【摘要】： 研究目的：1.建立大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)體外分離、擴增方法；2.探索攜帶BDNF的高拷貝質粒的構建以及轉染骨髓MSCs的方法；3.探討經側腦室移植骨髓MSCs、空質粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs對AD大鼠行為學、海馬CA1區(qū)組織病理學改變的影響；4.探討經側腦室移植骨髓MSCs、空質粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs對AD大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB表達的影響。 研究方法：1.取SD大鼠股骨骨髓,經貼壁篩選法進行體外培養(yǎng),采用免疫熒光方法鑒定骨髓MSCs表面的抗體CD29,CD44,CD34;2.將pEGFP-BDNF質粒進行改造與pIRESneo相連結,構建攜帶BDNF的高拷貝質粒pIRESneo-EGFP-BDNF,采用電穿孔技術轉染骨髓MSCs,經G418篩選,通過倒置熒光顯微鏡在藍色光下激發(fā)綠色光判斷轉染效率,采用Western blot方式判定轉染細胞是否表達BDNF蛋白；3.40只健康雄性成年SD大鼠隨機分為Sham組,AD組,MSCs組,CON組,BDNF組。采用雙側海馬注射Aβ25～35誘導AD大鼠模型,經側腦室移植骨髓MSCs、空質粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs觀察對AD大鼠在定位航行試驗以及空間探索試驗中行為學改變,光鏡下海馬CA1區(qū)HE染色、尼氏體染色的變化以及電鏡下海馬CA1區(qū)神經元及突觸超微結構的變化；4.采用RT-PCR及Western blot方式,觀察經側腦室移植骨髓MSCs、空質粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs對AD大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB表達的影響。 結果：1.SD大鼠長骨骨髓經過貼壁培養(yǎng)獲得的細胞具有MSCs的表型,并且經過反復貼壁傳代獲得純度較高,活性較好的MSCs;2.pIRESneo-EGFP-BDNF經過雙酶切鑒定,攜帶EGFP及BDNF基因,以EGFP基因為報告基因,質粒構建成功：通過電穿孔技術以及G418篩選,明顯提高pIRESneo-EGFP-BDNF轉染骨髓MSCs的效率；3.Morris水迷宮實驗結果提示：AD組與Sham組大鼠比較平均逃避潛伏期(AEL)延長、跨越平臺次數明顯減少(P0.05或P0.01), MSCs組、CON組、BDNF組與AD組大鼠比較AEL明顯縮短、跨越平臺次數顯著增加(P0.05或P0.01), BDNF組與CON組或MSCs組大鼠比較AEL顯著縮短(P0.05或P0.01),跨越平臺次數明顯增加(P0.05),而MSCs組與CON組比較無統計學意義(P0.05)；病理組織學結果；AD組大鼠海馬CA1區(qū)神經元細胞數目減少,細胞排列不整齊,細胞器損害較重,突觸小泡減少,突觸間隙模糊,突觸數目減少；MSCs組、CON組、BDNF組SD大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞帶保持較好的完整性,細胞排列較整齊,細胞器超微結構損害較輕,突觸小泡及突觸數目減少有所減輕,突觸間隙比較清楚,以BDNF組改善更為明顯；4. RT-PCR結果表明：各組大鼠海馬組織中均表達BDNFmRNA、TrkBmRNA, AD組與Sham組比較表達量明顯減低(P0.01); MSCs組、CON組、BDNF組BDNFmRNA、TrkBmRNA的表達均較AD組明顯提高(P0.01),其中CON組與MSCs組比較無明顯差異(P0.01),而BDNF組與CON組或MSCs組比較表達均顯著提高(P0.05); Western blot結果表明：各組大鼠海馬組織中均表達BDNF蛋白、TrkB蛋白,AD組與Sham組比較表達量明顯減低(P0.01); MSCs組、CON組、BDNF組BDNF蛋白、TrkB蛋白的表達均較AD組明顯提高(P0.01),其中CON組與MSCs組比較無明顯差異(P0.01),而BDNF組與CON組或MSCs組比較均顯著提高(P0.05)。 結論：1.通過體外貼壁篩選法擴增培養(yǎng),獲得大量純度較高、活性較好的骨髓MSCs;2.電轉染是很好的基因轉染干細胞,提高轉染效率的方法,使用電轉染方法轉染骨髓MSCs可以提高轉染效率；3.雙側海馬注射Aβ25～35成功誘導AD大鼠模型,方法簡單,成功率高；經過側腦室移植BDNF修飾骨髓MSCs或MSCs可以提高AD大鼠學習記憶能力,減輕大鼠海馬CA1區(qū)的神經元及突觸的損傷,以前者改善更為明顯,因此認為BDNF在神經修復中起著重要作用；4.經側腦室移植BDNF修飾的骨髓MSCs或骨髓MSCs干預AD大鼠模型,可以提高海馬區(qū)BDNF、TrkB的表達,以前者更為明顯,有可能是干預治療AD的機制之一。
【圖文】：

兔疫熒光雙染發(fā)現，在本實驗條件下培養(yǎng)的貼壁細胞具有CD44(圖l.4B)的兔疫表型，不具有CD34的免疫表型，符合抗體的特征。所取P3，PS，PS代CD29陽性細胞數分別94D44陽性細胞數分別95%，98%，90%，CD34陽性細胞數分。因此骨髓MSCs貼壁生長方式能得到純化的細胞，此種培養(yǎng)純度都比較高，可用于后續(xù)實驗。大鼠骨髓Mscs經液氮凍存后復蘇Mscs經液氮凍存3個月后復蘇，種植于25cm，的培養(yǎng)瓶中95%飽和濕度的孵箱培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的液1次，約第6一8天后達到90%的融合，細胞形態(tài)較凍存前無凍存后的細胞仍具有良好的增殖能力，可用于實驗研究。

PIRESne。載體用EcoRV和Notl進行雙酶切，酶切完后產物經回收純化后，以適合的濃度經 T4DNA連接酶連接，，構建成高效重組表達載體PI既sneo一EGFP一BDNF，載體構建路線圖譜見圖2.1。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R749.16

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本文編號：2660708