【摘要】： 研究目的：1.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離、擴(kuò)增方法；2.探索攜帶BDNF的高拷貝質(zhì)粒的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)染骨髓MSCs的方法；3.探討經(jīng)側(cè)腦室移植骨髓MSCs、空質(zhì)粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs對(duì)AD大鼠行為學(xué)、海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變的影響；4.探討經(jīng)側(cè)腦室移植骨髓MSCs、空質(zhì)粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs對(duì)AD大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB表達(dá)的影響。 研究方法：1.取SD大鼠股骨骨髓,經(jīng)貼壁篩選法進(jìn)行體外培養(yǎng),采用免疫熒光方法鑒定骨髓MSCs表面的抗體CD29,CD44,CD34;2.將pEGFP-BDNF質(zhì)粒進(jìn)行改造與pIRESneo相連結(jié),構(gòu)建攜帶BDNF的高拷貝質(zhì)粒pIRESneo-EGFP-BDNF,采用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓MSCs,經(jīng)G418篩選,通過(guò)倒置熒光顯微鏡在藍(lán)色光下激發(fā)綠色光判斷轉(zhuǎn)染效率,采用Western blot方式判定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否表達(dá)BDNF蛋白；3.40只健康雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為Sham組,AD組,MSCs組,CON組,BDNF組。采用雙側(cè)海馬注射Aβ25～35誘導(dǎo)AD大鼠模型,經(jīng)側(cè)腦室移植骨髓MSCs、空質(zhì)粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs觀察對(duì)AD大鼠在定位航行試驗(yàn)以及空間探索試驗(yàn)中行為學(xué)改變,光鏡下海馬CA1區(qū)HE染色、尼氏體染色的變化以及電鏡下海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)的變化；4.采用RT-PCR及Western blot方式,觀察經(jīng)側(cè)腦室移植骨髓MSCs、空質(zhì)粒修飾骨髓MSCs、BDNF修飾骨髓MSCs對(duì)AD大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB表達(dá)的影響。 結(jié)果：1.SD大鼠長(zhǎng)骨骨髓經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)獲得的細(xì)胞具有MSCs的表型,并且經(jīng)過(guò)反復(fù)貼壁傳代獲得純度較高,活性較好的MSCs;2.pIRESneo-EGFP-BDNF經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定,攜帶EGFP及BDNF基因,以EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因,質(zhì)粒構(gòu)建成功：通過(guò)電穿孔技術(shù)以及G418篩選,明顯提高pIRESneo-EGFP-BDNF轉(zhuǎn)染骨髓MSCs的效率；3.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：AD組與Sham組大鼠比較平均逃避潛伏期(AEL)延長(zhǎng)、跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P0.05或P0.01), MSCs組、CON組、BDNF組與AD組大鼠比較AEL明顯縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P0.05或P0.01), BDNF組與CON組或MSCs組大鼠比較AEL顯著縮短(P0.05或P0.01),跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P0.05),而MSCs組與CON組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；病理組織學(xué)結(jié)果；AD組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞排列不整齊,細(xì)胞器損害較重,突觸小泡減少,突觸間隙模糊,突觸數(shù)目減少；MSCs組、CON組、BDNF組SD大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞帶保持較好的完整性,細(xì)胞排列較整齊,細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)損害較輕,突觸小泡及突觸數(shù)目減少有所減輕,突觸間隙比較清楚,以BDNF組改善更為明顯；4. RT-PCR結(jié)果表明：各組大鼠海馬組織中均表達(dá)BDNFmRNA、TrkBmRNA, AD組與Sham組比較表達(dá)量明顯減低(P0.01); MSCs組、CON組、BDNF組BDNFmRNA、TrkBmRNA的表達(dá)均較AD組明顯提高(P0.01),其中CON組與MSCs組比較無(wú)明顯差異(P0.01),而BDNF組與CON組或MSCs組比較表達(dá)均顯著提高(P0.05); Western blot結(jié)果表明：各組大鼠海馬組織中均表達(dá)BDNF蛋白、TrkB蛋白,AD組與Sham組比較表達(dá)量明顯減低(P0.01); MSCs組、CON組、BDNF組BDNF蛋白、TrkB蛋白的表達(dá)均較AD組明顯提高(P0.01),其中CON組與MSCs組比較無(wú)明顯差異(P0.01),而BDNF組與CON組或MSCs組比較均顯著提高(P0.05)。 結(jié)論：1.通過(guò)體外貼壁篩選法擴(kuò)增培養(yǎng),獲得大量純度較高、活性較好的骨髓MSCs;2.電轉(zhuǎn)染是很好的基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞,提高轉(zhuǎn)染效率的方法,使用電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染骨髓MSCs可以提高轉(zhuǎn)染效率；3.雙側(cè)海馬注射Aβ25～35成功誘導(dǎo)AD大鼠模型,方法簡(jiǎn)單,成功率高；經(jīng)過(guò)側(cè)腦室移植BDNF修飾骨髓MSCs或MSCs可以提高AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,減輕大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元及突觸的損傷,以前者改善更為明顯,因此認(rèn)為BDNF在神經(jīng)修復(fù)中起著重要作用；4.經(jīng)側(cè)腦室移植BDNF修飾的骨髓MSCs或骨髓MSCs干預(yù)AD大鼠模型,可以提高海馬區(qū)BDNF、TrkB的表達(dá),以前者更為明顯,有可能是干預(yù)治療AD的機(jī)制之一。
【圖文】：

兔疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞具有CD44(圖l.4B)的兔疫表型，不具有CD34的免疫表型，符合抗體的特征。所取P3，PS，PS代CD29陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別94D44陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別95%，98%，90%，CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分。因此骨髓MSCs貼壁生長(zhǎng)方式能得到純化的細(xì)胞，此種培養(yǎng)純度都比較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。大鼠骨髓Mscs經(jīng)液氮凍存后復(fù)蘇Mscs經(jīng)液氮凍存3個(gè)月后復(fù)蘇，種植于25cm，的培養(yǎng)瓶中95%飽和濕度的孵箱培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的液1次，約第6一8天后達(dá)到90%的融合，細(xì)胞形態(tài)較凍存前無(wú)凍存后的細(xì)胞仍具有良好的增殖能力，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

PIRESne。載體用EcoRV和Notl進(jìn)行雙酶切，酶切完后產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，以適合的濃度經(jīng) T4DNA連接酶連接，，構(gòu)建成高效重組表達(dá)載體PI既sneo一EGFP一BDNF，載體構(gòu)建路線圖譜見(jiàn)圖2.1。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2660708