發(fā)布時(shí)間：2020-05-06 07:22

【摘要】：研究目的:阿爾茨海默癥是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病,患者癥狀主要表現(xiàn)為失憶、認(rèn)知功能喪失、人格改變及失語(yǔ)癥等,嚴(yán)重影響患者的人際交往和工作生活。據(jù)相關(guān)權(quán)威統(tǒng)計(jì),患者人數(shù)占全世界65歲以上人口的6%,而阿爾茨海默癥的發(fā)病率逐年上升且增長(zhǎng)幅度也在不斷增加。阿爾茨海默癥已經(jīng)成為人類健康的一大危害因素。盡管阿爾茨海默癥已經(jīng)有了幾十年的研究歷史,但是它的發(fā)病機(jī)制仍未被闡明。通過(guò)解剖發(fā)現(xiàn),患者腦組織內(nèi)存在大量的由Aβ蛋白高度聚合而成老年斑,因此Aβ蛋白作為阿爾茨海默癥的標(biāo)志物被廣泛的研究。近幾年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明,相比于由Aβ蛋白高度聚合而成的老年斑,分布于細(xì)胞膜中可溶性的Aβ蛋白寡聚體具有明顯的細(xì)胞毒性。因此,細(xì)化的研究Aβ寡聚體的結(jié)構(gòu)性質(zhì),寡聚體與膜之間的相互作用以及寡聚體的聚合機(jī)制對(duì)抑制Aβ寡聚體的細(xì)胞毒性具有重要的意義。其中Aβ42二聚體作為Aβ蛋白寡聚體最小聚合單位同樣也是最小的毒性單位被廣泛的研究,闡明Aβ42二聚體的結(jié)構(gòu)特征,與膜的相互作用以及聚合機(jī)制將有助于阿爾茨海默的治療方案的提出。研究方法:由于通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)Aβ二聚體的結(jié)構(gòu)是高度可變,無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定二聚體的結(jié)構(gòu),本文將根據(jù)之前對(duì)Aβ42二聚體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果選取結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的四種聚合形式(2NCB、CNNC、NCNC、NCCN)使用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)進(jìn)行Aβ42二聚體的結(jié)構(gòu)特征,與膜的相互作用以及聚合機(jī)制進(jìn)行探究。1.構(gòu)建體系我們先對(duì)由128個(gè)DPPC分子組成的細(xì)胞膜進(jìn)行40ns的平衡模擬,選取平衡后的DPPC膜結(jié)構(gòu)作為構(gòu)建體系的初始膜結(jié)構(gòu)。初始的四種二聚體分別垂直于膜表面豎直插入DPPC膜中,插入的深度與之前實(shí)驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果一致。Aβ42多肽的N端極性區(qū)位于DPPC膜上片層的磷脂層,其上的兩個(gè)β折疊在膜中的方向是與磷脂層垂直。對(duì)插入二聚體的復(fù)合體系填充SPC水分子,并且移除位于DPPC膜疏水區(qū)域的水分子,然后在體系內(nèi)加入適量的Na~+和CL~-離子用于平衡體系自身的電荷。2.平衡態(tài)分子動(dòng)力學(xué)模擬本次實(shí)驗(yàn)所有的分子動(dòng)力學(xué)模擬都是通過(guò)軟件Gromacs(version of 5.-rc1)進(jìn)行的,模擬所選用的力場(chǎng)為經(jīng)過(guò)修改,添加了DPPC分子參數(shù)的GROMOS96 53A6力場(chǎng)。在正式的模擬之前體系需要先經(jīng)歷兩個(gè)平衡步驟:NVT和NPT平衡,消除體系中不合理的原子間位置。經(jīng)歷了NVT和NPT平衡后,對(duì)四個(gè)體系都進(jìn)行400ns的模擬,在模擬過(guò)程中施加在體系內(nèi)所有原子上的限制力都會(huì)被移除。體系內(nèi)的長(zhǎng)程靜電相互作用將在周期性邊界條件下使用PME方法進(jìn)行計(jì)算。3.傘形取樣以二聚體兩條鏈的質(zhì)心距離為反應(yīng)坐標(biāo),將其中一條鏈固定,對(duì)另一條鏈沿Y軸方向施加牽引力,牽引速率為0.01 nm/ps,牽引力常數(shù)k=1000kJ/mol/nm2,直到二聚體完全分離。在反應(yīng)路徑中每隔0.1nm~0.12nm設(shè)置一個(gè)窗口,每個(gè)體系設(shè)置32個(gè)窗口,對(duì)每個(gè)窗口進(jìn)行10ns平衡模擬。研究結(jié)果:1.Aβ42二聚體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)根據(jù)組成Aβ多肽的氨基酸性質(zhì),Aβ多肽可以被分為兩個(gè)部分,N端極性區(qū)域和C端疏水區(qū)域。根據(jù)DSSP分析發(fā)現(xiàn),在模擬過(guò)程中二聚體2NCB中一共存在五個(gè)區(qū)域具有高度的β折疊傾向,兩個(gè)區(qū)域位于N端極性區(qū),第一個(gè)區(qū)域由第2到5位氨基酸組成,第二區(qū)域由第11到14位氨基酸組成。另外三個(gè)區(qū)域位于C端疏水區(qū),第三個(gè)區(qū)域由第17到22位氨基酸組成,第四個(gè)區(qū)域由第31到36位氨基酸組成,第五個(gè)區(qū)域由第39到41位氨基酸組成。與2NCB相比,其他三種二聚體在C端疏水區(qū)域同樣存在三個(gè)高度β折疊傾向的區(qū)域,且位置類似。在N端極性區(qū)域則有著明顯的區(qū)別,CNNC、NCNC和NCCN這三種二聚體在2NCB的N端極性區(qū),表現(xiàn)出明顯的低β折疊傾向性,相應(yīng)的無(wú)規(guī)則卷曲的傾向性增加。2.Aβ42二聚體對(duì)膜的影響通過(guò)分析嵌入不同二聚體DPPC膜的APL和流動(dòng)性發(fā)現(xiàn),四種二聚體對(duì)膜存在不同程度的破壞作用,這種破壞作用主要可能是由二聚體N端的β折疊引起的,N端β折疊最穩(wěn)定的2NCB對(duì)細(xì)胞膜的影響最大。基于研究結(jié)果,在四種二聚體之中,二聚體2NCB有著最大的可能性進(jìn)行進(jìn)一步的聚合,同時(shí)也是潛在的毒性結(jié)構(gòu)。3.Aβ42二聚體分離過(guò)程的關(guān)鍵點(diǎn)基于傘形取樣的結(jié)果對(duì)Aβ二聚體的分離過(guò)程進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),四種二聚體具有不同的鏈間接觸面。2NCB的接觸面位于極性區(qū),由兩條鏈的E11到H14組成。CNNC、NCNC和NCCN的接觸面位于疏水區(qū):CNNC的接觸面由兩條鏈的L17到E22組成;NCNC的接觸面由第一條鏈的L17到E22和第二條鏈的V39到A42接觸組成;NCCN的接觸面由兩條鏈的V39到A42相互接觸組成。另外隨著兩條多肽鏈之間距離的增加,四種二聚體多肽之間的氫鍵分別在兩個(gè)多肽質(zhì)心距離為2.7nm(2NCB),3.2nm(CNNC),3.3nm(NCNC)和2.1nm(NCCN)處全部被破壞。四種二聚體最后被破壞的氫鍵分別是,H14-H14(2NCB),F20-F20(CNNC),A43-F20(NCNC),A43-A43(NCCN)。研究結(jié)論:1.模擬過(guò)程中四種二聚體可以穩(wěn)定的存在于DPPC膜之中。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),在C端疏水區(qū)四種二聚體具有類似的結(jié)構(gòu),在N端極性區(qū)域則有著明顯的區(qū)別。相比于CNNC、NCNC和NCCN這三種二聚體,2NCB在N端的β折疊更加穩(wěn)定。2.四種二聚體對(duì)膜存在不同程度的破壞作用,破壞作用主要可能是由二聚體N端的β折疊引起的,N端β折疊最穩(wěn)定的2NCB對(duì)細(xì)胞膜的影響最大。3.四種二聚體存在不同的聚合接觸面,分離路徑也不盡相同。通過(guò)對(duì)比最后斷裂的氫鍵發(fā)現(xiàn)His14,Phe20,Ala42是結(jié)合關(guān)鍵點(diǎn)。針對(duì)這三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行修飾可能對(duì)Aβ42二聚體的聚合產(chǎn)生很大的影響。
【圖文】：

然后在體系內(nèi)加入 6 個(gè) Na+離子用于平衡體系自身的電荷。構(gòu)建完畢的體系如圖1.1圖 1.1 構(gòu)建好的四種膜蛋白復(fù)合體系，藍(lán)色區(qū)域?yàn)?N 端親水區(qū)，紅色區(qū)域是C 端疏水區(qū)。使用不同大小和顏色的球體代表水分子（淺藍(lán)色）和磷原子（黃色），DPPC 雙層膜的疏水側(cè)鏈（酰基鏈）以青色線表示。1.1.3 平衡態(tài)分子動(dòng)力學(xué)模擬本次實(shí)驗(yàn)所有的分子動(dòng)力學(xué)模擬都是在軟件 Gromacs（version of 5.-rc1）上進(jìn)行，，模擬所選用的力場(chǎng)為經(jīng)過(guò)修改，添加了 DPPC 分子參數(shù)的 GROMOS9653A6 力場(chǎng)[64-65]。采用 NVT 和 NPT 兩個(gè)平衡模擬去除體系中有沖突的原子間作用力。首先進(jìn)行 NVT 平衡，平衡過(guò)程中限制 DPPC 分子和二聚體的運(yùn)動(dòng)，體系溫度設(shè)置為 323K，運(yùn)用 v-rescale 恒溫器限制體系的體積

結(jié)果如圖1.2。從圖中可以看出在整個(gè)模擬過(guò)程中，四種二聚體在前 100ns 模擬過(guò)程中出現(xiàn)了不同程度的結(jié)構(gòu)波動(dòng)，但在之后 300ns 模擬過(guò)程中四種二聚體結(jié)構(gòu)的 RMSD值逐漸收斂，這說(shuō)明四種二聚體的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。圖 1.2 膜環(huán)境中四種二聚體在 400ns 模擬過(guò)程 RMSD 值的波動(dòng)圖，黑色為2NCb，紅色為 CNNC，藍(lán)色為 NCCN，綠色為 NCNC。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16

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