【摘要】：研究目的:阿爾茨海默癥是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病,患者癥狀主要表現(xiàn)為失憶、認知功能喪失、人格改變及失語癥等,嚴重影響患者的人際交往和工作生活。據(jù)相關(guān)權(quán)威統(tǒng)計,患者人數(shù)占全世界65歲以上人口的6%,而阿爾茨海默癥的發(fā)病率逐年上升且增長幅度也在不斷增加。阿爾茨海默癥已經(jīng)成為人類健康的一大危害因素。盡管阿爾茨海默癥已經(jīng)有了幾十年的研究歷史,但是它的發(fā)病機制仍未被闡明。通過解剖發(fā)現(xiàn),患者腦組織內(nèi)存在大量的由Aβ蛋白高度聚合而成老年斑,因此Aβ蛋白作為阿爾茨海默癥的標志物被廣泛的研究。近幾年來越來越多的證據(jù)表明,相比于由Aβ蛋白高度聚合而成的老年斑,分布于細胞膜中可溶性的Aβ蛋白寡聚體具有明顯的細胞毒性。因此,細化的研究Aβ寡聚體的結(jié)構(gòu)性質(zhì),寡聚體與膜之間的相互作用以及寡聚體的聚合機制對抑制Aβ寡聚體的細胞毒性具有重要的意義。其中Aβ42二聚體作為Aβ蛋白寡聚體最小聚合單位同樣也是最小的毒性單位被廣泛的研究,闡明Aβ42二聚體的結(jié)構(gòu)特征,與膜的相互作用以及聚合機制將有助于阿爾茨海默的治療方案的提出。研究方法:由于通過實驗觀測發(fā)現(xiàn)Aβ二聚體的結(jié)構(gòu)是高度可變,無法準確測定二聚體的結(jié)構(gòu),本文將根據(jù)之前對Aβ42二聚體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果選取結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的四種聚合形式(2NCB、CNNC、NCNC、NCCN)使用分子動力學(xué)模擬對進行Aβ42二聚體的結(jié)構(gòu)特征,與膜的相互作用以及聚合機制進行探究。1.構(gòu)建體系我們先對由128個DPPC分子組成的細胞膜進行40ns的平衡模擬,選取平衡后的DPPC膜結(jié)構(gòu)作為構(gòu)建體系的初始膜結(jié)構(gòu)。初始的四種二聚體分別垂直于膜表面豎直插入DPPC膜中,插入的深度與之前實驗觀測結(jié)果一致。Aβ42多肽的N端極性區(qū)位于DPPC膜上片層的磷脂層,其上的兩個β折疊在膜中的方向是與磷脂層垂直。對插入二聚體的復(fù)合體系填充SPC水分子,并且移除位于DPPC膜疏水區(qū)域的水分子,然后在體系內(nèi)加入適量的Na~+和CL~-離子用于平衡體系自身的電荷。2.平衡態(tài)分子動力學(xué)模擬本次實驗所有的分子動力學(xué)模擬都是通過軟件Gromacs(version of 5.-rc1)進行的,模擬所選用的力場為經(jīng)過修改,添加了DPPC分子參數(shù)的GROMOS96 53A6力場。在正式的模擬之前體系需要先經(jīng)歷兩個平衡步驟:NVT和NPT平衡,消除體系中不合理的原子間位置。經(jīng)歷了NVT和NPT平衡后,對四個體系都進行400ns的模擬,在模擬過程中施加在體系內(nèi)所有原子上的限制力都會被移除。體系內(nèi)的長程靜電相互作用將在周期性邊界條件下使用PME方法進行計算。3.傘形取樣以二聚體兩條鏈的質(zhì)心距離為反應(yīng)坐標,將其中一條鏈固定,對另一條鏈沿Y軸方向施加牽引力,牽引速率為0.01 nm/ps,牽引力常數(shù)k=1000kJ/mol/nm2,直到二聚體完全分離。在反應(yīng)路徑中每隔0.1nm~0.12nm設(shè)置一個窗口,每個體系設(shè)置32個窗口,對每個窗口進行10ns平衡模擬。研究結(jié)果:1.Aβ42二聚體的結(jié)構(gòu)特點根據(jù)組成Aβ多肽的氨基酸性質(zhì),Aβ多肽可以被分為兩個部分,N端極性區(qū)域和C端疏水區(qū)域。根據(jù)DSSP分析發(fā)現(xiàn),在模擬過程中二聚體2NCB中一共存在五個區(qū)域具有高度的β折疊傾向,兩個區(qū)域位于N端極性區(qū),第一個區(qū)域由第2到5位氨基酸組成,第二區(qū)域由第11到14位氨基酸組成。另外三個區(qū)域位于C端疏水區(qū),第三個區(qū)域由第17到22位氨基酸組成,第四個區(qū)域由第31到36位氨基酸組成,第五個區(qū)域由第39到41位氨基酸組成。與2NCB相比,其他三種二聚體在C端疏水區(qū)域同樣存在三個高度β折疊傾向的區(qū)域,且位置類似。在N端極性區(qū)域則有著明顯的區(qū)別,CNNC、NCNC和NCCN這三種二聚體在2NCB的N端極性區(qū),表現(xiàn)出明顯的低β折疊傾向性,相應(yīng)的無規(guī)則卷曲的傾向性增加。2.Aβ42二聚體對膜的影響通過分析嵌入不同二聚體DPPC膜的APL和流動性發(fā)現(xiàn),四種二聚體對膜存在不同程度的破壞作用,這種破壞作用主要可能是由二聚體N端的β折疊引起的,N端β折疊最穩(wěn)定的2NCB對細胞膜的影響最大�；谘芯拷Y(jié)果,在四種二聚體之中,二聚體2NCB有著最大的可能性進行進一步的聚合,同時也是潛在的毒性結(jié)構(gòu)。3.Aβ42二聚體分離過程的關(guān)鍵點基于傘形取樣的結(jié)果對Aβ二聚體的分離過程進行分析發(fā)現(xiàn),四種二聚體具有不同的鏈間接觸面。2NCB的接觸面位于極性區(qū),由兩條鏈的E11到H14組成。CNNC、NCNC和NCCN的接觸面位于疏水區(qū):CNNC的接觸面由兩條鏈的L17到E22組成;NCNC的接觸面由第一條鏈的L17到E22和第二條鏈的V39到A42接觸組成;NCCN的接觸面由兩條鏈的V39到A42相互接觸組成。另外隨著兩條多肽鏈之間距離的增加,四種二聚體多肽之間的氫鍵分別在兩個多肽質(zhì)心距離為2.7nm(2NCB),3.2nm(CNNC),3.3nm(NCNC)和2.1nm(NCCN)處全部被破壞。四種二聚體最后被破壞的氫鍵分別是,H14-H14(2NCB),F20-F20(CNNC),A43-F20(NCNC),A43-A43(NCCN)。研究結(jié)論:1.模擬過程中四種二聚體可以穩(wěn)定的存在于DPPC膜之中。通過對比發(fā)現(xiàn),在C端疏水區(qū)四種二聚體具有類似的結(jié)構(gòu),在N端極性區(qū)域則有著明顯的區(qū)別。相比于CNNC、NCNC和NCCN這三種二聚體,2NCB在N端的β折疊更加穩(wěn)定。2.四種二聚體對膜存在不同程度的破壞作用,破壞作用主要可能是由二聚體N端的β折疊引起的,N端β折疊最穩(wěn)定的2NCB對細胞膜的影響最大。3.四種二聚體存在不同的聚合接觸面,分離路徑也不盡相同。通過對比最后斷裂的氫鍵發(fā)現(xiàn)His14,Phe20,Ala42是結(jié)合關(guān)鍵點。針對這三個位點進行修飾可能對Aβ42二聚體的聚合產(chǎn)生很大的影響。
【圖文】：

然后在體系內(nèi)加入 6 個 Na+離子用于平衡體系自身的電荷。構(gòu)建完畢的體系如圖1.1圖 1.1 構(gòu)建好的四種膜蛋白復(fù)合體系，藍色區(qū)域為 N 端親水區(qū)，紅色區(qū)域是C 端疏水區(qū)。使用不同大小和顏色的球體代表水分子（淺藍色）和磷原子（黃色），DPPC 雙層膜的疏水側(cè)鏈（�；湥┮郧嗌�表示。1.1.3 平衡態(tài)分子動力學(xué)模擬本次實驗所有的分子動力學(xué)模擬都是在軟件 Gromacs（version of 5.-rc1）上進行，，模擬所選用的力場為經(jīng)過修改，添加了 DPPC 分子參數(shù)的 GROMOS9653A6 力場[64-65]。采用 NVT 和 NPT 兩個平衡模擬去除體系中有沖突的原子間作用力。首先進行 NVT 平衡，平衡過程中限制 DPPC 分子和二聚體的運動，體系溫度設(shè)置為 323K，運用 v-rescale 恒溫器限制體系的體積

結(jié)果如圖1.2。從圖中可以看出在整個模擬過程中，四種二聚體在前 100ns 模擬過程中出現(xiàn)了不同程度的結(jié)構(gòu)波動，但在之后 300ns 模擬過程中四種二聚體結(jié)構(gòu)的 RMSD值逐漸收斂，這說明四種二聚體的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。圖 1.2 膜環(huán)境中四種二聚體在 400ns 模擬過程 RMSD 值的波動圖，黑色為2NCb，紅色為 CNNC，藍色為 NCCN，綠色為 NCNC。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16

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本文編號：2650901