【摘要】：人口老化帶來的阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)患病人數(shù)的劇增是威脅全球社保體系的最重要因素之一。AD在臨床上的主要表現(xiàn)為空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙、認(rèn)知功能障礙、失認(rèn)失用、語言障礙以及性格精神及行為發(fā)生異常等。目前全球大約有5000萬患者,而預(yù)計(jì)到2050年這一數(shù)字將增到1.52億。大量研究證實(shí)AD患者中女性多于男性,呈3:1的發(fā)病機(jī)率并且多見于絕經(jīng)后的女性。因此,老化導(dǎo)致的雌激素(主要是17β-estradiol,E2)水平下降被認(rèn)為是AD的主要致病因素之一。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)雌激素替代治療(estrogen replacement therapy,ERT)在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙從而在一定程度上有助于AD的預(yù)防和治療。但ERT治療的效果還存在爭議,長期的ERT還有導(dǎo)致乳腺癌等雌激素反應(yīng)性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn),因此尋找在雌激素缺乏條件下預(yù)防和治療AD新的靶點(diǎn)至關(guān)重要。腦是雌激素作用的重要靶區(qū)之一。腦內(nèi)雌激素的來源包括來自外周循環(huán)中的雌激素(主要是卵巢雌激素),以及腦局部尤其是海馬神經(jīng)元經(jīng)芳香化酶(aromatase,AROM)催化雄激素轉(zhuǎn)變而來的雌激素即海馬源性雌激素。卵巢切除術(shù)(ovariectomy,OVX)以及注射芳香化酶活性抑制劑如來曲唑(letrozole,LET)常用來制備雌激素缺乏模型,由于LET能透過血腦屏障因而也常被用來制備海馬雌激素缺乏模型。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)OVX和LET處理均能抑制海馬CA1區(qū)樹突棘密度和突觸密度、調(diào)節(jié)actin細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化,提示循環(huán)雌激素和海馬雌激素對海馬突觸可塑性均有重要的調(diào)節(jié)作用并由此改變小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,但是卵巢雌激素和海馬雌激素造成小鼠行為異常是通過哪些基因改變引起的、這些基因是如何參與雌激素對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為的調(diào)節(jié)等核心問題目前還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1(Serum/glucocorticoid-induced protein kinase-1,SGK1)是在大鼠乳腺癌細(xì)胞受血清和/或糖皮質(zhì)激素刺激時(shí)迅速轉(zhuǎn)錄的一種絲氨/蘇氨酸蛋白激酶。SGK1廣泛表達(dá)于人體內(nèi),參與調(diào)控離子通道、細(xì)胞遷移、環(huán)腺苷酸結(jié)合反應(yīng)元件等轉(zhuǎn)錄因子的功能,并在細(xì)胞增殖與凋亡、神經(jīng)元興奮性以及激素分泌等過程中發(fā)揮重要作用。為數(shù)不多的文獻(xiàn)報(bào)道SGK1能改善AD的相關(guān)病理,減少Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活;或是通過磷酸化調(diào)節(jié)其它蛋白如FE65減少Aβ生成及積聚的作用從而緩解AD病情。但SGK1在雌激素調(diào)控小鼠學(xué)習(xí)記憶的過程中扮演了怎樣的角色尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。海馬是與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的腦區(qū)之一,其突觸可塑性(包括突觸形態(tài)、突觸密度、突觸傳遞與突觸功能的可塑性)對學(xué)習(xí)記憶能力有重要的影響,突觸蛋白表達(dá)的變化是突觸傳遞與功能可塑性的基礎(chǔ),肌動(dòng)蛋白(actin)聚合與解聚的動(dòng)態(tài)變化是樹突棘密度和突觸密度變化的基礎(chǔ)。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏不僅會降低突觸蛋白的表達(dá)水平也會影響actin細(xì)胞骨架聚合的動(dòng)態(tài)變化。AD最主要的病理改變即為老年斑形成、神經(jīng)原纖維纏結(jié)與神經(jīng)元丟失,其中老年斑的形成主要是不可溶性的β淀粉樣蛋白(beta-amyloid,Aβ)沉積所致。淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)可被α、β、γ分泌酶裂解,其中α分泌酶的裂解產(chǎn)物為可溶性的Aβ,而β、γ分泌酶的裂解產(chǎn)物為不可溶性的Aβ。對于不可溶性的Aβ,有研究發(fā)現(xiàn)它可被胰島素降解酶(Insulin degradation enzyme,IDE)及腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)分解。文獻(xiàn)報(bào)道雌激素缺乏可改變Aβ代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平從而加重Aβ的沉積,盡管SGK1在減少Aβ生成及積聚中也起到了非常重要的作用,但其在雌激素缺乏導(dǎo)致小鼠AD病理改變中的作用如何還未見文獻(xiàn)報(bào)道。雌激素通過雌激素受體發(fā)揮調(diào)控作用,雌激素受體包括雌激素核受體(ERα和ERβ)和雌激素膜受體(G Protein-coupled Receptor 30,GPR30),課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GPR30與小鼠突觸可塑性密切相關(guān)且涉及到對mTORC2及其核心成分Rictor,但是GPR30以及Rictor的作用是否與SGK1的表達(dá)相關(guān)還不清楚。為了深入探討雌激素調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制與SGK1在其中的作用,本課題主要進(jìn)行了以下研究:1.為了在轉(zhuǎn)錄水平探討雌激素對海馬基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,我們制備了OVX和LET注射兩種雌激素缺乏模型,利用轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)對OVX和LET處理小鼠進(jìn)行差異基因的篩選,結(jié)合生物信息學(xué)分析預(yù)測與雌激素作用最相關(guān)的分子,并通過WB和qPCR對芯片結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGK1在兩種雌激素缺乏模型中表達(dá)均顯著下降。2.為了探究SGK1在雌激素調(diào)控小鼠學(xué)習(xí)記憶中的作用,我們構(gòu)建了SGK1過表達(dá)的腺相關(guān)病毒,然后采用OVX的模型及海馬立體定位注射病毒載體的方式,探討SGK1是否能夠逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶行為下降;利用WB和qPCR驗(yàn)證了病毒有效性,用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的變化。3.為了探討SGK1在雌激素調(diào)控小鼠學(xué)習(xí)記憶中的機(jī)制,我們利用上述模型,通過Western blot技術(shù)(WB)檢測了小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白(PSD95、GluR1、Spinophilin和Synaptophysin)和actin細(xì)胞骨架聚合調(diào)節(jié)蛋白(Profilin和Cofilin)的表達(dá)變化,用高爾基鍍銀染色和透射電鏡檢測了海馬CA1區(qū)樹突棘密度及突觸密度的變化。4.為了探討SGK1對雌激素缺乏小鼠AD病理的影響,我們用WB檢測了小鼠海馬特異性過表達(dá)SGK1對Aβ與Aβ代謝相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響,用剛果紅染色和免疫組化染色分別檢測了海馬老年斑的形成和Aβ沉積的差異。5.為了探討SGK1在GPR30/mTORC2通路調(diào)控小鼠海馬突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶中的作用,我們結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),利用行為學(xué)、WB和免疫熒光技術(shù)檢測了GPR30/mTORC2通路對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的調(diào)控及與SGK1表達(dá)之間的關(guān)系。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.轉(zhuǎn)錄組芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)在p0.05、fc1.5時(shí),OVX/Sham篩選出143個(gè)差異基因,LET/DMSO篩選出136個(gè)差異基因。其中,OVX和LET均可引起Gm10717、Gm11116表達(dá)上調(diào)以及SGK1、Nfkbia表達(dá)下調(diào)。SGK1在Genemania功能預(yù)測上與雌激素受體相關(guān),強(qiáng)烈提示其可能參與了雌激素對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為的調(diào)控。2.與假手術(shù)組相比,OVX導(dǎo)致小鼠在前五天的定位訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中找到平臺的逃避潛伏期明顯延長、在第六天的空間記憶檢測實(shí)驗(yàn)中通過平臺次數(shù)和第三象限停留時(shí)間均顯著減少;而OVX小鼠海馬注射過表達(dá)SGK1的AAV后前五天逃避潛伏期縮短、第六天通過平臺次數(shù)和第三象限停留時(shí)間顯著增加,基本上恢復(fù)到假手術(shù)動(dòng)物水平。3.海馬特異性過表達(dá)SGK1可以逆轉(zhuǎn)OVX導(dǎo)致的突觸相關(guān)蛋白、骨架相關(guān)蛋白表達(dá)改變以及CA1區(qū)突觸密度和樹突棘密度降低。4.海馬過表達(dá)SGK1可以逆轉(zhuǎn)OVX導(dǎo)致的Aβ及其代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的變化、降低BACE1的水平并提高IDE的表達(dá)水平,但對Aβ沉積和老年斑的產(chǎn)生無影響。5.GPR30失活可抑制E2誘導(dǎo)的mTORC2、SGK1、突觸蛋白和actin聚合等改變;活化mTORC2可逆轉(zhuǎn)GPR30失活誘導(dǎo)的空間記憶損傷和肌動(dòng)蛋白解聚,而抑制Rictor則可降低SGK1的表達(dá)水平。主要結(jié)論:1.OVX和LET均可導(dǎo)致海馬多個(gè)基因表達(dá)的顯著變化,SGK1是最顯著下調(diào)的基因之一,生物信息學(xué)表明它是和雌激素受體相關(guān)的基因,表明SGK1在雌激素調(diào)節(jié)海馬的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮了重要作用。2.海馬過表達(dá)SGK1可改善OVX小鼠的突觸可塑性、抑制Aβ的生成同時(shí)促進(jìn)其代謝,從而在雌激素調(diào)節(jié)空間學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。3.SGK1可能參與了GPR30/mTORC2通路對小鼠海馬突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)。4.以上研究結(jié)果為闡明雌激素調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),為AD的預(yù)防和治療提供了潛在的靶點(diǎn)。
【圖文】：

-1. 雌性小鼠去勢手術(shù)。A：腹背側(cè)備皮。B：找出兩側(cè)C：卵巢切除并結(jié)扎。D：依次縫合手術(shù)創(chuàng)口。縫合組織后，用碘酒擦拭消毒皮膚并滴加青霉素預(yù)，將小鼠置于 28℃溫箱中待其蘇醒；內(nèi)密切觀察小鼠狀態(tài)。溶劑注射處理同一日開始腹腔注射 LET 卵巢切除，每天取一管分按 100 μl/只的劑量腹腔注射(160 μg/kg)；DMSO上午 8-10 點(diǎn)給藥，持續(xù)給藥 30 天。情周期的鑒定0.9%生理鹽水、防脫載玻片、20μl 移液器、HE 染好標(biāo)記后，抓取小鼠并固定在手心，用移液槍吸取吸 5-7 次；

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文后被備用；麻醉后斷頸法處死，在冰上剝離腦組織，，并置于被生理鹽水浸組織沿正中線切成兩半，分離出海馬組織，一分為二，放入組以 qPCR 及芯片測序。錄組芯片檢測的海馬樣品取出進(jìn)行基因分析，此部分由上海伯豪生物技流程圖如圖 2-2（由伯豪公司提供的）：
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16

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