【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種和年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,導(dǎo)致認(rèn)知功能的逐步喪失。在AD的病理過程中,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活,產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)產(chǎn)物,其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)是膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子。本課題組前期的研究工作已經(jīng)證實(shí):AD模型大鼠腦中海馬區(qū)和皮質(zhì)額葉區(qū),炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量顯著增高。經(jīng)中藥治療后海馬組織和皮質(zhì)額葉中TNF-α和IL-1β含量顯著降低。 國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),在中風(fēng)、腦損傷、帕金森氏癥等其他腦病中,患者腦中均有不同程度的炎癥反應(yīng)。其中,炎癥因子TNF-α和IL-1β在患者腦中大量表達(dá),并與膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)一起廣泛存在。因此,將炎癥因子TNF-α和IL-1β作為我們的研究對(duì)象,對(duì)腦病炎癥發(fā)病機(jī)制的深入研究和中藥從炎癥論治腦病的生物學(xué)機(jī)制研究都具有普遍意義。 本人的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)是,在體外建立穩(wěn)定表達(dá)炎癥因子TNF-α和IL-1β的細(xì)胞系。在成功建立細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,進(jìn)行中藥從炎癥治療腦系疾病的分子生物學(xué)機(jī)制研究,為中藥分子藥理學(xué)和藥物靶點(diǎn)的研究提供合適的細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)手段。 目的: 在體外,構(gòu)建帶有炎癥因子TNF-α和IL-1β基因序列的真核表達(dá)載體;進(jìn)一步在哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞上,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)炎癥因子TNF-α和IL-1β的細(xì)胞系。 方法: 1以克隆載體pCMVSport-TNF-α和pCMVSport-IL-1β為擴(kuò)增模板,使用高保真聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡(jiǎn)稱PCR),獲得目的基因(即炎癥因子TNF-α和IL-1β的基因序列); 2將真核表達(dá)載體pFLAG-CMV、pcDNA3.1和擴(kuò)增得到的目的基因TNF-α、IL-1β分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng),并通過連接反應(yīng),將目的基因TNF-α、IL-1β分別連入真核表達(dá)載體pFLAG-CMV、pcDNA3.1; 3對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切(與空載體比較)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)和目的基因堿基測(cè)序,鑒定四種重組質(zhì)粒,即pFLAG-CMV-TNF-α、pFLAG-CMV-IL-1β、pcDNA3.1-TNF-α、pcDNA3.1-IL-1β,是否構(gòu)建成功。 4選取HEK293細(xì)胞,使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,采用重組真核表達(dá)載體pFLAG-CMV-TNF-α和pFLAG-CMV-IL-1β轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞HEK293。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),進(jìn)行G418的抗性篩選,加入G418后的第2天,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化;加入G418后的第6天,細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡;加入G418后的第10天,出現(xiàn)單克隆細(xì)胞,并將細(xì)胞消化至48孔板中,保證每孔一個(gè)細(xì)胞,改變G418的濃度為維持濃度,即篩選取濃度的一半;加入G418后的第21天,單克隆細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞集落,并呈現(xiàn)島狀;繼續(xù)培養(yǎng)1-2周,細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)孔,進(jìn)行消化細(xì)胞,傳代,凍存或是裂解檢測(cè)。 5蛋白質(zhì)印跡(Western blot)方法檢測(cè)上述獲得的細(xì)胞系中炎癥因子的表達(dá)情況。首先,裂解細(xì)胞,使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定上樣量,利用炎癥因子TNF-α和IL-1β的抗體,進(jìn)行目的蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。 結(jié)果: 1以克隆載體pCMVSport-TNF-α和pCMVSport-IL-1β為擴(kuò)增模板,成功擴(kuò)增目的基因。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,目的基因TNF-α和IL-1β均在預(yù)期位置,即TNF-α大小位置在700bp,IL-1β大小位置在800bp。已知目的基因TNF-α大小為701 bp,IL-1β大小為809bp。 2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pFLAG-CMV-TNF-α、pFLAG-CMV-IL-1β、pcDNA3.1-TNF-α、pcDNA3.1-IL-1β經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ單酶切,所得片段均大于空載體單酶切片段大小、經(jīng)PCR反應(yīng)均擴(kuò)增得到目的片段。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序,使用DNAStar軟件將測(cè)序結(jié)果與GeneBank中人類TNF-α和IL-1β進(jìn)行序列比對(duì)分析,結(jié)果顯示,目的基因與GeneBank中一致。表明,目的基因準(zhǔn)確無誤連入真核表達(dá)載體。已知GeneBank中人類TNF-α序列號(hào)為NM_000594、人類IL-1β序列號(hào)為NM_000576。 3穩(wěn)定表達(dá)炎癥因子TNF-α和IL-1β細(xì)胞株成功建立。使用重組質(zhì)粒pFLAG-CMV-TNF-α和pFLAG-CMV-IL-1β,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,G418做為抗性篩選試劑。建系結(jié)果是,獲得3株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入pFLAG-CMV的HEK293細(xì)胞,作為陰性對(duì)照,分別標(biāo)號(hào)pf1、pf2、pf3;6株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入pFLAG-CMV-TNF-α的HEK293細(xì)胞,分別標(biāo)號(hào)為T1、T2、T3、T4、T5、T6;5株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入pFLAG-CMV-IL-1β的HEK293細(xì)胞,分別標(biāo)號(hào)為I1、I2、I3、I4、I5。 4 Western blot檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)量。首先,蛋白定量,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為y=2203.9x-790.85,其中R~2=0.985。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞株T1、T3、T4均能較高表達(dá)炎癥因子TNF-α;細(xì)胞株I2、I3、I5均能較高表達(dá)炎癥因子IL-1β。 結(jié)論: 1通過高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),能夠準(zhǔn)確無誤從克隆載體pCMVSport-TNF-α和pCMVSport-IL-1β上擴(kuò)增得到炎癥因子TNF-α和IL-1β的基因序列,并與GeneBank中的序列一致。 2重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建,表現(xiàn)在:一,目的基因準(zhǔn)確無誤的連入真核表達(dá)載體;二,目的基因能夠在真核表達(dá)載體上得到翻譯,即連入基因的“讀碼框”順序正確。 3穩(wěn)定表達(dá)炎癥因子TNF-α和IL-1β的細(xì)胞系建系成功。重組質(zhì)粒DNA整合進(jìn)HEK293細(xì)胞染色體中,目的基因能夠在HEK293細(xì)胞中有效表達(dá),并會(huì)遺傳給下一代細(xì)胞。
【圖文】：

圖1:質(zhì)粒單酶切鑒定。其中，1一8為質(zhì)粒PFLAG-公I(xiàn)V，l一4是提取純化體積為SOul，用酶Hind工工、B;如IHI、Kpnl、Xbal單酶切結(jié)果;5一8是提取純化戶漸只為3Oul，用酶Hindlll、B朋淚1、Kpnl、Xb單酶切結(jié)果;9一16為質(zhì)粒peDNA3.1，9一12提取純化體積為SOul，用酶Hindlll、B乏班婦1、Kpn工、Xb單酶切結(jié)果;1于16是提取純化體積為3Oul，用酶Hind工工工、B朋淚1、Kpnl、xbal單酶切結(jié)果的單切結(jié)果。

增條帶為目的條帶。圖3圖3:Marker是 IOObpDNALadder，其條帶中最亮一條為50Obp，1是hILI，，由ILlp一e一Fl、ILlp一e一l擴(kuò)增所得;2是hILlp由引物ILlp一e一1、ILlp一e一BZ擴(kuò)增所得。hILlp擴(kuò)增長(zhǎng)度為809bpo
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2620951