【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),又稱老年癡呆,是以記憶、認(rèn)知功能受損為主要特征的神經(jīng)退行性疾病,其典型的病理學(xué)特征為老年斑(senile plaque, SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)和大量的神經(jīng)元喪失。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是老年斑的主要成分,由39～43個(gè)氨基酸組成。有關(guān)Aβ1-40和Aβ1-42完整肽鏈的神經(jīng)毒作用已有廣泛的報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35,一個(gè)短的分子片斷,具有與Aβ完整肽鏈相同的神經(jīng)毒作用,因此被廣泛應(yīng)用于AD的實(shí)驗(yàn)研究。由于Aβ被普遍認(rèn)為是AD的關(guān)鍵性致病因素,在AD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,因而深入研究其毒性作用機(jī)制,從而抑制其毒性將是防治AD的重要環(huán)節(jié)。 有關(guān)Aβ的毒性機(jī)制眾說紛紜,近來(lái)研究表明,Aβ通過擾亂細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài),影響膜電生理特性而發(fā)揮重要作用。大量研究證實(shí),鉀離子通道的功能紊亂在AD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。鉀離子通道能夠影響胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞容積,并通過調(diào)節(jié)膜電位調(diào)控遞質(zhì)釋放、激素分泌等生理功能。在幾乎所有興奮性細(xì)胞和絕大多數(shù)非興奮性細(xì)胞靜息膜電位的維持過程中鉀通道發(fā)揮主要作用,同時(shí)還可影響動(dòng)作電位的頻率和時(shí)程,由此調(diào)控細(xì)胞的興奮性以及參與Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。此外,研究表明,鉀通道在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用,鉀通道與Cp20 (一種分子量為20 kDa的GTP結(jié)合蛋白)、胞內(nèi)鈣離子、蛋白激酶C (PKC)共同參與學(xué)習(xí)和記憶的過程。病理?xiàng)l件下,如發(fā)生AD時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中均存在鉀通道功能異常。近來(lái)研究還發(fā)現(xiàn),鉀通道除影響膜電生理特性、興奮性和鈣穩(wěn)態(tài)及一些生理及病理過程,還參與神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo),促進(jìn)凋亡發(fā)生。 然而鉀通道功能異常產(chǎn)生的神經(jīng)損傷作用與AD的病理變化關(guān)系十分混亂。雖有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,但存在很大爭(zhēng)議,特別是在不同的實(shí)驗(yàn)條件(如電生理記錄和細(xì)胞培養(yǎng))觀察時(shí),甚至有結(jié)果相反的報(bào)道。一方面,鉀通道功能異常造成的毒性作用報(bào)道不一。既有鉀通道開放抑制、鉀電流減少引起毒性作用(興奮性提高、鈣超載)的報(bào)道,也有鉀通道開放增加、鉀電流增大引起的毒性作用(誘導(dǎo)凋亡)的報(bào)道。另一方面,Aβ對(duì)鉀通道功能的毒性作用結(jié)果也報(bào)道不一,既有抑制通道開放使鉀電流減少的結(jié)果,也有促使通道開放使鉀外流增加的報(bào)道。因此有必要做進(jìn)一步研究并分析其機(jī)制及原因,明確Aβ在產(chǎn)生毒性作用時(shí)對(duì)鉀通道功能的影響,明確鉀通道功能異常產(chǎn)生的毒性作用,從而為解釋鉀通道的病理生理作用及Aβ的毒性作用機(jī)制提供依據(jù)。 蛋白激酶C (PKC)作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)物質(zhì),參與許多生理功能的調(diào)節(jié)。在對(duì)鉀通道的調(diào)節(jié)過程中,PKC尤為重要。研究顯示,PKC激活可使鉀電流抑制。而且有證據(jù)顯示,Aβ的毒性作用與PKC密切相關(guān)。本研究室以往的研究也證實(shí)PKC介導(dǎo)了Aβ31-35引起的海馬長(zhǎng)持續(xù)-長(zhǎng)時(shí)程(L-LTP)壓抑。那么,PKC是否也參與了Aβ所致的鉀通道功能的異常改變呢?此外,本室及其他的研究者以往的工作表明,Aβ能引起神經(jīng)元細(xì)胞活力降低、促進(jìn)凋亡發(fā)生,那么鉀通道是否也參與Aβ引起的細(xì)胞凋亡過程? Humanin (HN)是2001年首次由日本學(xué)者在AD患者腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的由24個(gè)氨基酸組成的線性多肽,能夠有效抑制多種FAD (Family Alzheimer’s disease)基因突變和Aβ衍生物誘發(fā)的神經(jīng)毒作用,初始被認(rèn)為是AD特異或AD相關(guān)毒性的神經(jīng)保護(hù)肽。然而有關(guān)HN拮抗Aβ的神經(jīng)毒作用機(jī)制還不清楚,尤其是對(duì)神經(jīng)元電生理特性的影響未見報(bào)道。而且,我們前期的實(shí)驗(yàn)觀察到HN能夠拮抗Aβ引起的凋亡而發(fā)揮保護(hù)作用,那么鉀通道是否在HN拮抗Aβ引起的毒性作用中發(fā)揮重要作用? 基于上述的研究背景,為進(jìn)一步明確Aβ對(duì)鉀通道功能的影響及鉀通道功能異常產(chǎn)生的毒性作用;為明確HN拮抗Aβ神經(jīng)毒的電生理(鉀通道)機(jī)制;明確PKC在Aβ引起鉀通道功能異常時(shí)的作用及HN的拮抗作用;明確鉀通道在Aβ所致凋亡中的作用以及HN的神經(jīng)保護(hù)作用,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下三部分實(shí)驗(yàn):(1)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Aβ對(duì)鈣非依賴性的鉀電流(包括快速失活鉀電流和延遲整流鉀電流)的影響,以及HN對(duì)Aβ引起的鉀通道功能改變的拮抗作用;(2)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)和免疫蛋白印跡技術(shù)觀察PKC在Aβ引起鉀通道功能改變過程中的作用和HN拮抗作用;(3)采用細(xì)胞毒性檢測(cè)方法和凋亡檢測(cè)手段,觀察鉀通道在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒尤其是誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生中的作用,以及HN的保護(hù)作用。為深入理解鉀通道功能異常、Aβ神經(jīng)毒性作用及AD的病理機(jī)制提供理論依據(jù)。 第一部分: Aβ25-35介導(dǎo)的鈣非依賴性鉀電流的抑制及HN的拮抗作用 為了深入理解Aβ的神經(jīng)毒作用的離子機(jī)制及探討HN發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的電生理機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Aβ25-35對(duì)急性分離的海馬神經(jīng)元鈣非依賴性的鉀電流(包括快速失活鉀電流(fast transient current,IA)和延遲整流鉀電流(delayed rectifier-like current,IK))的影響以及HN的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)過程中,我們采用三種不同的給藥順序進(jìn)行觀察,即在灌流Aβ之前、同時(shí)或之后給予同等濃度的HN。在全細(xì)胞電壓鉗記錄的條件下,給予細(xì)胞由-40～+70mV(階躍10mV)的去極化脈沖,分別記錄鈣非依賴性的總的鉀電流和IK電流,再經(jīng)公式換算得出IA。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,IK取其158ms處的穩(wěn)態(tài)電流,而IA取其峰值電流進(jìn)行分析。在同一海馬神經(jīng)元上,比較HN不同的給藥方式對(duì)Aβ引起的鉀電流作用的影響。 結(jié)果顯示:(1)單獨(dú)應(yīng)用Aβ25-35 (5 mol/L),使鈣非依賴性的總的鉀電流、IK和IA都受到明顯的抑制,其相對(duì)電流幅度分別為66.23±10.29% (n=11, p0.05)、71.94±11.20% (n=11, p0.05)和47.95±19.25% (n=11, p0.05);(2)HN (5 mol/L)預(yù)處理取消了Aβ25-35 (5 mol/L)對(duì)鈣非依賴性的鉀電流的抑制作用。在HN預(yù)處理?xiàng)l件下,給予Aβ25-35后,其電流幅度基本不變(103.70±6.64%和80.16±9.78%, n=8, p0.05),即HN取消了Aβ對(duì)鉀電流的抑制;(3)HN (5 mol/L)后處理逆轉(zhuǎn)了Aβ25-35 (5 mol/L)引起的對(duì)鈣非依賴性鉀電流的抑制�？偟拟涬娏�、IK和IA電流幅度分別為80.50±10.05% (n=11)、87.49±13.50% (n=11)和59.71±22.75% (n=11),同Aβ25-35處理組相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=11, p0.05);(4)HN (5 mol/L)與Aβ25-35 (5 mol/L)同時(shí)作用于神經(jīng)元時(shí),HN同樣拮抗了Aβ25-35對(duì)鉀通道的抑制作用�？偟拟涬娏�,IK,IA相對(duì)電流幅度分別為122.82±18.89% (n=5), 116.46±17.40% (n=5), 99.71±30.42% (n=5),同Aβ25-35處理組相比,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=5, p 0.05);(5)Aβ25-35以及使用鉀通道的阻斷劑TEA和4-AP或提高細(xì)胞外鉀離子濃度能夠顯著的增高細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平;(6) HN與Aβ25-35同時(shí)作用于神經(jīng)元時(shí),HN能夠拮抗Aβ25-35引起的胞內(nèi)鈣升高。 以上結(jié)果表明:(1)急性給予Aβ25-35可使分離神經(jīng)元的鈣非依賴性的總的鉀電流包括IK、IA抑制,這種作用可能通過提高興奮性影響鈣穩(wěn)態(tài),如形成鈣超載而發(fā)揮毒性作用;(2)HN拮抗Aβ25-35介導(dǎo)的對(duì)鈣非依賴性鉀電流的抑制以及胞內(nèi)鈣升高;(3)電壓依賴性鉀通道可能是HN拮抗Aβ發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一;(4)結(jié)合以往實(shí)驗(yàn)和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè),HN和Aβ可能作用于細(xì)胞膜同一靶點(diǎn)而發(fā)揮作用,HN比Aβ可能更具有親和力。 第二部分: PKC介導(dǎo)的Aβ25-35對(duì)鉀通道的抑制及HN的拮抗作用 鑒于PKC在鉀通道調(diào)節(jié)過程中的重要作用,即PKC激活可抑制鉀電流以及廣泛報(bào)道的PKC介導(dǎo)Aβ的毒性作用。在第一部分研究結(jié)果的基礎(chǔ)上(Aβ抑制鈣非依賴性鉀電流),通過使用PKC的激動(dòng)劑PDBu和阻斷劑chelerythrine,應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察PKC是否介導(dǎo)了Aβ對(duì)鈣非依賴性鉀電流的抑制和HN的拮抗作用。同時(shí),采用蛋白免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步觀察Aβ對(duì)PKC的活化以及HN的拮抗作用。 結(jié)果顯示:(1)不同濃度的PKC激動(dòng)劑PDBu (1 mol/L, 10 mol/L, 100 mol/L)能夠劑量依賴性抑制延遲整流鉀電流(IK),相對(duì)于對(duì)照組,IK的電流幅度分別為85.00±5.75% (n=5, p 0.05), 67.13±6.83% (n=5, p 0.05)和54.25±8.90% (n=5, p 0.05)。而快速失活鉀電流(IA)則不受PDBu的影響;(2)PKC阻斷劑chelerythrine (20 mol/L)能夠拮抗Aβ引起的對(duì)IK的抑制。鈣非依賴性的總的鉀電流和IK相對(duì)于正常電流幅度分別為107.08±6.54% (n=12)和106.90±20.54% (n=12),而同單獨(dú)應(yīng)用Aβ25-35 (5 mol/L)時(shí)兩種電流的相對(duì)值分別為66.23±10.29% (n=11)和71.94±11.20% (n=11),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)(;3)HN拮抗PKC激動(dòng)劑PDBu引起的對(duì)IK的抑制。第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),HN能拮抗Aβ25-35介導(dǎo)的對(duì)鈣非依賴性鉀電流的抑制,且前述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ通過PKC介導(dǎo)其對(duì)IK的抑制。因此,我們觀察了HN對(duì)PKC激動(dòng)劑PDBu引起IK抑制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PDBu (5 mol/L)之后給予HN (5 mol/L),IK相對(duì)電流幅度升高為84.60±6.79% (n=8,p 0.05 vs PDBu組),即HN能夠拮抗由PDBu引起的對(duì)IK的抑制作用;(4)Aβ25-35促進(jìn)神經(jīng)元PKC的活化。Aβ25-35 (5 mol/L)作用30 min后能夠激活PKC,即磷酸化的PKC明顯增多,而Aβ(5 mol/L)和HN (5 mol/L)共同作用30 min后,同單獨(dú)應(yīng)用Aβ組相比,PKC的磷酸化水平不再增加(n=4, p0.05)。 以上結(jié)果表明:(1)PKC激動(dòng)劑劑量依賴性的抑制IK,即激活PKC模擬了Aβ對(duì)鉀通道的作用;(2)Aβ能夠活化(磷酸化)神經(jīng)元PKC,活化的PKC介導(dǎo)了對(duì)鉀通道的抑制,而PKC阻斷劑拮抗Aβ引起的IK電流的抑制;(3)HN抑制Aβ誘導(dǎo)的PKC的活化(磷酸化);(4)HN拮抗PKC介導(dǎo)的Aβ對(duì)IK的抑制。綜上,Aβ通過活化PKC介導(dǎo)其對(duì)鉀通道的作用,這可能是Aβ毒性作用的重要機(jī)制之一,抑制Aβ對(duì)PKC的活化及抑制PKC介導(dǎo)的毒性作用可能是HN拮抗Aβ神經(jīng)毒的機(jī)制之一。 第三部分:鉀通道開放介導(dǎo)的Aβ25-35致凋亡及HN的拮抗作用 我們前一部分的實(shí)驗(yàn)及其他一些電生理實(shí)驗(yàn)觀察顯示,Aβ能夠抑制鉀通道開放及鉀電流,使膜電位負(fù)值變小,由此導(dǎo)致膜容易去極化,動(dòng)作電位的時(shí)程和有效不應(yīng)期延長(zhǎng),胞內(nèi)鈣內(nèi)流增多,繼發(fā)鈣超載,從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。新近的文獻(xiàn)報(bào)道,鉀通道開放增加、鉀外流增多亦可產(chǎn)生毒性作用,但不是影響興奮性和鈣信號(hào)而是誘導(dǎo)凋亡。在培養(yǎng)的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)慢性孵育Aβ通過引起鉀通道開放增加,大量鉀外流誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。上述Aβ對(duì)鉀通道的不同作用(通道抑制,鉀電流減少或通道開放,鉀外流增加)是在不同的實(shí)驗(yàn)條件下觀察的結(jié)果,前者是在電生理記錄條件下通過急性給藥觀察的結(jié)果,后者是在細(xì)胞培養(yǎng)條件下慢性孵育藥物觀察的結(jié)果。我們?cè)谕瓿闪穗娚項(xiàng)l件下進(jìn)行的Aβ對(duì)鉀通道功能影響的觀察后,設(shè)計(jì)了本部分實(shí)驗(yàn),即使用原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元,觀察鉀通道在Aβ引起的神經(jīng)元凋亡中的作用及HN的拮抗作用。 實(shí)驗(yàn)中采用鉀通道的阻斷劑,包括對(duì)IK敏感的TEA和其同源類似物TPeA以及對(duì)IA敏感的4-AP以及使用高濃度的KCl提高細(xì)胞外鉀離子濃度來(lái)抑制鉀離子外流,觀察阻止鉀離子過渡外流能否拮抗Aβ引起的神經(jīng)元死亡;同時(shí)應(yīng)用鉀離子的載體valinomycin(相當(dāng)于開放劑)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡(這是目前研究鉀外流增多引起凋亡的通用模型),在此基礎(chǔ)上觀察HN對(duì)鉀外流增多引起凋亡的拮抗作用,明確HN拮抗Aβ引起神經(jīng)元死亡的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)過程采用原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元,通過細(xì)胞毒性檢測(cè)方法(cck-8試劑盒,乳酸脫氫酶試劑盒,Calcein-AM染色)和凋亡檢測(cè)方法(流式細(xì)胞術(shù),caspase-3試劑盒,TUNEL染色)分析鉀通道在Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。 結(jié)果顯示:(1)Aβ25-35 (25 mol/L)孵育24 h引起皮層神經(jīng)元的凋亡,使用鉀通道(IK)的阻斷劑TEA (5 mmol/L)、TPeA (1 nmol/L )或提高細(xì)胞外的鉀離子濃度(KCl 25 mmol/L)預(yù)處理30分鐘,抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而IA的阻斷劑4-AP (5 mmol/L)預(yù)孵育則對(duì)Aβ25-35引起的神經(jīng)元凋亡沒有保護(hù)作用;(2)鉀離子載體valinomycin (10 nmol/L, 100 nmol/L, 1000 nmol/L)通過鉀通道的開放,鉀離子的外流劑量依賴性的降低神經(jīng)元的細(xì)胞活力,并導(dǎo)致凋亡發(fā)生;(3) HN (5 mol/L)預(yù)處理16 h能夠拮抗由valinomycin(100 nmol/L)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而15 mol/L和25 mol/L HN卻未能發(fā)揮保護(hù)作用;(4)HN (25 mol/L)預(yù)處理16 h能夠拮抗Aβ25-35 (25 mol/L)引起的皮層神經(jīng)元凋亡。 以上結(jié)果表明:(1)在離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的條件下,Aβ導(dǎo)致培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡;(2)Aβ引起的神經(jīng)元凋亡與慢性孵育Aβ引起鉀通道開放導(dǎo)致鉀離子大量外流有關(guān);(3)HN可拮抗鉀通道開放誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。綜上,HN可通過拮抗鉀通道開放抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,這可能是HN拮抗Aβ致凋亡作用的機(jī)制之一 綜上結(jié)果,可得出如下結(jié)論: (1)急性給予Aβ25-35可使分離的神經(jīng)元鈣非依賴的鉀通道(鉀電流)抑制,包括IA和IK,進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高; HN可拮抗由Aβ25-35誘導(dǎo)的鈣非依賴性的鉀電流的抑制以及胞內(nèi)鈣升高; (2)Aβ25-35可能通過活化PKC系統(tǒng)介導(dǎo)對(duì)鉀電流的抑制; (3)HN通過拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PKC活化(磷酸化)從而拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的對(duì)鉀電流的抑制; (4)慢性孵育Aβ25-35導(dǎo)致培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡,鉀通道的大量開放可能是介導(dǎo)Aβ25-35致凋亡的機(jī)制之一; (5)HN可通過拮抗鉀通道開放抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,這可能是HN拮抗Aβ致凋亡作用的機(jī)制之一; (6)鉀通道功能異常無(wú)論是開放抑制(鉀電流減小)或開放增加(鉀外流增加)均可造成毒性作用,前者通過提高神經(jīng)興奮性或引起胞內(nèi)鈣超載而產(chǎn)生毒性作用,而后者則通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮毒性作用; (7)不同的實(shí)驗(yàn)條件及給藥方式可能通過不同的機(jī)制使Aβ產(chǎn)生對(duì)鉀通道的不同效應(yīng)。電生理記錄過程的急性給藥使通道抑制,鉀電流減小;而細(xì)胞培養(yǎng)過程的慢性孵育可使通道開放增加,鉀外流增加。急性給藥產(chǎn)生的鉀通道抑制可能是Aβ對(duì)膜通道及膜電流產(chǎn)生的直接效應(yīng),而慢性孵育可能是由于上調(diào)了鉀通道蛋白表達(dá),使其數(shù)量增加,開放增加。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R749.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2611608