【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人常見的一種慢性進行性神經(jīng)退行性疾病,目前針對AD的藥物治療效果不明顯,僅對輕中度AD患者的癡呆癥狀有所改善或延緩癡呆進展,不能治愈或阻止疾病發(fā)展。由于AD的發(fā)病原因及機制沒有完全清楚,研究開發(fā)出真正具有預(yù)防或治療作用的藥物將有廣闊的前景和深遠的意義。AD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征是大量形成以過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)及由β-淀粉樣多肽(β-amyloid, Aβ)組成的神經(jīng)細胞間的大量老年斑(senile plaques,SP),tau蛋白過度磷酸化被發(fā)現(xiàn)是AD的早期改變,而且AD患者的臨床癡呆程度僅與NFTs的數(shù)量密切相關(guān),因此研究針對以tau蛋白過度磷酸化及其機制為靶點的藥物可能是防治AD的有效方法。 去氫吳茱萸堿(dehydroevodiamine, DHED)是從吳茱萸未成熟果實中提取的單體化合物生物堿。本研究主要目的是探討DHED在wotmanni(nWT)及GF-109203X(GFX)引起的AD樣病理變化模型中的藥理作用及其機制。 我們尾靜脈注射給予DHED(6.25 mg/kg/day或12.5 mg/kg/day)或生理鹽水7天,同時進行Morris水迷宮訓(xùn)練,第8天在大鼠側(cè)腦室聯(lián)合注射10μl濃度為100μM的PI3K特異性抑制劑wortmannin (WT)及PKC的特異性抑制劑GF-109203X (GFX)。側(cè)腦室注射24h后進行Morris水迷宮測試檢測大鼠空間記憶保留功能,水迷宮測試后取材進行免疫印跡及免疫組化檢測。結(jié)果顯示: 1.DHED可改善WT/GFX引起的空間記憶保留障礙 側(cè)腦室注射WT/GFX 24h后,大鼠搜尋水迷宮平臺的時間延長,搜尋軌跡雜亂,大鼠表現(xiàn)空間記憶保留障礙,預(yù)先給予DHED 7天可以明顯縮短大鼠尋找平臺的時間,搜尋策略也得以改善,由雜亂無章變成趨向式搜尋。結(jié)果表明預(yù)先給予DHED能有效改善因WT/GFX所致的大鼠空間記憶障礙。 2. DHED可減輕WT/GFX引起的大鼠海馬tau蛋白過度磷酸化側(cè)腦室注射WT/GFX 24h后,免疫印跡檢測tau蛋白磷酸化的抗體PHF-1及PS396顯色增強,而識別非磷酸化位點的tau-1顯色減弱,表明WT/GFX可以引起tau蛋白在Ser396/404及Ser199/202位點發(fā)生過度磷酸化,12.5 mg/kg/day的DHED可以減輕tau蛋白在PHF-1、PS396及tau-1位點的磷酸化,而低濃度6.25 mg/kg/day的DHED僅可減輕PS396位點的磷酸化。用R134d檢測了總tau蛋白水平,各個實驗組均無明顯變化。免疫組織化學(xué)檢測tau蛋白磷酸化情況,結(jié)果顯示側(cè)腦室注射WT/GFX 24h后,PHF-1在大鼠海馬CA3區(qū)的陽性染色明顯增強,而tau-1在海馬CA3區(qū)的陽性染色明顯減弱,表示W(wǎng)T/GFX可導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化,用DHED處理后,WT/GFX引起的PHF-1及tau-1的染色改變均明顯減輕,表明DHED能減輕WT/GFX導(dǎo)致的tau蛋白在PHF-1及tau-1位點的過度磷酸化。 3. DHED可減輕WT/GFX誘導(dǎo)的大鼠海馬GSK-3β過度激活通過免疫印跡檢測大鼠海馬GSK-3β的免疫反應(yīng),盡管其總GSK-3β水平在各組均無明顯變化,與對照組相比,注射WT/GFX后其非活性形式Ser9磷酸化的GSK-3β降低,預(yù)先給予DHED可增加Ser9磷酸化GSK-3β的水平,表明DHED能抑制WT/GFX所致的GSK-3β過度激活。 為了進一步研究在細胞水平激活GSK-3β對tau蛋白過度磷酸化的影響以及DHED的保護作用,我們用不同濃度的DHED預(yù)處理野生型鼠成神經(jīng)瘤(N2a)細胞株24h,然后用濃度為1μM的WT/GFX處理細胞1h。結(jié)果顯示: 1. DHED可減輕WT/GFX引起的N2a細胞tau蛋白過度磷酸化 DHED 5、10μM預(yù)處理細胞24h均能明顯減輕WT/GFX所致的tau蛋白在Ser396/404及Ser199/202位點過度磷酸化(p0.01),兩個濃度的DHED降低tau蛋白磷酸化的作用沒有差別;單獨用DHED處理細胞對tau蛋白磷酸化沒有明顯影響。 2. DHED可減輕N2a細胞的GSK-3β過度激活 通過免疫印跡檢測細胞GSK-3β的免疫反應(yīng),與對照組相比,總GSK-3β水平在各組均無明顯變化,1μM的WT/GFX處理1h后其非活性形式Ser9磷酸化的GSK-3β降低到41%(p0.01);5、10μM的DHED預(yù)處理細胞24h均可逆轉(zhuǎn)WT/GFX所致的Ser9磷酸化GSK-3β下降,分別上升到81%(5μM)及87%(10μM)(p0.01),表明DHED能減輕WT/GFX激活的GSK-3β。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)WT/GFX處理后細胞的Ser9磷酸化GSK-3β顯色減弱,而PHF-1的顯色加強,用DHED 10μM預(yù)處理細胞24h可以明顯逆轉(zhuǎn)WT/GFX所致的變化。 瞬時轉(zhuǎn)染wtGSK-3β到N2a細胞后用10μM DHED處理24h。DHED可以降低N2a細胞過表達外源性GSK-3β的活性及抑制其引起的tau蛋白過度磷酸化,進一步證明DHED可以抑制GSK-3β的活性。 3. DHED可以增加N2a細胞的Akt(PKB)磷酸化水平 Akt是使GSK-3β的Ser9發(fā)生磷酸化的最重要的磷酸激酶,其通過Ser473及Thr308兩個位點磷酸化得以激活。我們檢測了N2a細胞的Akt磷酸化水平,與對照組相比,總Akt水平在各組均無明顯變化,但1μM的WT/GFX處理1h后Akt在Ser473及Thr-308位點磷酸化水平降低(p0.01);DHED預(yù)處理細胞24h可增加Akt在Ser473及Thr-308位點的磷酸化水平,說明DHED可以促進Akt激活。 根據(jù)上述結(jié)果,我們得出以下結(jié)論,WT/GFX激活GSK-3β,從而導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化,DHED可以通過抑制GSK-3β活性從而降低tau蛋白的磷酸化,其抑制GSK-3β可能是通過激活A(yù)kt來實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R749.16;R285.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 錢云;張志s，

本文編號：2610498