【摘要】：第一部分體外鈣離子孵育對(duì)C57BL/6小鼠腦神經(jīng)元及PC12細(xì)胞內(nèi)PKA-RⅡα分子量表達(dá)的影響 目的探討cAMP依賴(lài)性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase, PKA)調(diào)節(jié)亞基Ⅱα(RⅡα)在C57BL/6小鼠腦神經(jīng)元體外鈣離子孵育及加入不同干擾因素條件下的表達(dá)變化。 方法取8只C57BL/6小鼠前腦組織勻漿裂解隨機(jī)分為8組,分別應(yīng)用以下條件予以處理：勻漿后不孵育作為對(duì)照1,不作處理僅30℃孵育10min作為對(duì)照2,應(yīng)用2.5mmol/LCaCl2孵育,CaCl2孵育前加入鈣離子螯合劑EDTA,CaCl2孵育后加入EDTA再次孵育,CaCl2孵育后加入堿性磷酸酶再次孵育,CaCl2孵育前應(yīng)用外源性PKA綁定蛋白Ht31孵育,CaCl2孵育前應(yīng)用無(wú)活性外源性PKA綁定蛋白Ht31P孵育；同時(shí)將大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC 12 cell)隨機(jī)分為8組,裂解后與前述做相同處理。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)腦組織及細(xì)胞內(nèi)RⅡα的表達(dá)情況 結(jié)果小鼠前腦組織及PC12細(xì)胞裂解產(chǎn)物中,對(duì)照組1和2內(nèi)RⅡα表觀分子量為51 kDa；與CaCl2孵育后,RⅡα表觀分子量為53kDa；若在CaCl2孵育前加入EDTA,則RⅡα分子量為51kDa;CaCl2呼育后加入EDTA則其分子量為53kDa；CaCl2孵育后加入堿性磷酸酶再次孵育,RⅡα分子量為51kDa；CaCl2孵育前加入Ht31或Ht31P,RⅡα分子量皆為53kDa。 結(jié)論RⅡα的分子量升高變化與Ca2+有關(guān),且能被磷酸酶逆轉(zhuǎn),與RⅡα的AKAP結(jié)合活性無(wú)關(guān)。 第二部分PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載對(duì)PKA調(diào)節(jié)亞基RⅡα表達(dá)的影響 目的探討細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載狀態(tài)下PKA各亞基的表達(dá)變化 方法分別應(yīng)用Aβ1-42寡聚體及KC1造成PC12細(xì)胞內(nèi)鈣超載。采用5μmol/L及10μmol/L的Aβ1-4237℃條件下分別孵育PC12細(xì)胞30min,1h,2h,4h,12h,采用50mmol/L及100mmol/L的KC137℃條件下分別孵育PC12細(xì)胞5min,10min,20min, 30min,60min。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RⅡα亞基的表達(dá)。 結(jié)果Aβ1-42寡聚體及KCl孵育PC12細(xì)胞后,皆對(duì)PC12細(xì)胞活性造成不同程度影響,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞活性逐漸下降。Western blot檢測(cè)孵育后PKA調(diào)節(jié)亞基RⅡα先出現(xiàn)蛋白分子量的升高現(xiàn)象,與第一部分結(jié)果相似,同時(shí),隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),RⅡ分子量回到正常水平。 結(jié)論Ap1-42寡聚體及KCl對(duì)PC12細(xì)胞有明顯毒性作用,并可致RⅡα蛋白分子量升高,其后則恢復(fù)到正常水平。 第三部分不同激酶抑制劑對(duì)RⅡα分子量變化的影響 目的研究不同激酶抑制劑對(duì)RⅡα分子量變化的影響,找出使得RⅡα分子量變化的具體激酶。 方法以5μmol/L的Aβ1-42寡聚體37℃條件下孵育PC12細(xì)胞2h及100mmol/L的KC137℃條件下孵育PC12細(xì)胞20min造成RⅡα分子量變化模型,以未處理的PC12細(xì)胞為空白對(duì)照,分別同時(shí)應(yīng)用PKA抑制劑H89、PKC抑制劑Staurosporine、CaM抑制劑W-7,應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組RⅡα分子量表達(dá)變化。 結(jié)果5μmol/L的Aβ1-42寡聚體處理PC12細(xì)胞2h及100mmol/L的KCl處理PC12細(xì)胞20min后,RⅡα分子量由51kDa上升為53kDa,同時(shí)分別應(yīng)用H89、Staurosporine,W-7后,僅W-7能逆轉(zhuǎn)這種分子量表達(dá)的變化。 結(jié)論RⅡα分子量的變化為CaMK所致的磷酸化,這種磷酸化與PKA或PKC無(wú)明顯關(guān)系。 第四部分Aβ1-42對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)PKA活性的影響 目的研究Aβ1-42孵育對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)PKA活性的影響 方法研究Aβ142寡聚體不同孵育時(shí)間下對(duì)PKA活性的影響,PC12細(xì)胞隨機(jī)分組如下：5μmol/L的Aβ1-42于37℃條件下分別孵育PC12細(xì)胞Omin、30min、1h、2h、4h、12h、;研究不同干預(yù)條件下鈣超載對(duì)PKA活性的影響,PC12細(xì)胞隨機(jī)分組如下：對(duì)照組：不作任何干預(yù),實(shí)驗(yàn)組：5μmol/L的Aβ1-42寡聚體于37℃C孵育2h,10μmol/L的W-7處理1h,10μmol/L的W-7預(yù)處理1h+5μmol/L的Aβ1-42寡聚體孵育2h, 50μmol/L的Ht31+5μmol/L的Aβ1-42寡聚體孵育2h,50μmol/L的Ht31P+5μmol/L的Aβ1-42寡聚體孵育2h。孵育后采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKA磷酸化底物表達(dá)水平,以證實(shí)PKA活性變化。 結(jié)果Aβ1-42寡聚體處理PC12細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKA底物表達(dá)先升高后降低,單用W-7對(duì)磷酸化PKA底物表達(dá)無(wú)明顯影響,Aβ1-42寡聚體干預(yù)前W-7的加入抑制了磷酸化PKA底物表達(dá)的升高,Ht31及Ht31P的加入均對(duì)磷酸化PKA底物表達(dá)無(wú)明顯影響。 結(jié)論Aβ1-42寡聚體所致細(xì)胞內(nèi)鈣超載顯著影響了PKA的活性,W-7抑制PKA活性升高可能與其抑制了RⅡα磷酸化有關(guān),PKA的活性變化與其AKAP結(jié)合位點(diǎn)無(wú)關(guān)。 第五部分鈣離子超載對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)CREB活性的影響 目的研究PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載狀態(tài)下,CREB活性的變化。 方法將PC12細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組不作任何干預(yù),Aβ1-42實(shí)驗(yàn)組分組如下：W-7組、Aβ1-42組、W-7+Ap1-42組,Aβ1-42+H89組、Aβ1-42+staurosporine組；KCl實(shí)驗(yàn)組分組如下：W-7組、KCl組、W-7+KC1組,KCl+H89組、KCl+staurosporine組。孵育后采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化CREB (pCREB)水平,以證實(shí)CREB活性變化。 結(jié)果Aβ1-42及KCl處理PC12細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)pCREB表達(dá)增加,單用W-7對(duì)pCREB表達(dá)無(wú)明顯影響,Aβ1-42及KC1干預(yù)前W-7的加入抑制了pCREB表達(dá)的升高,H89的加入顯著減少了pCREB的表達(dá),staurosporine的加入對(duì)pCREB表達(dá)變化無(wú)明顯影響。 結(jié)論Aβ1-42及KC1所致細(xì)胞內(nèi)鈣超載顯著影響了CREB的激活,W-7可抑制CREB的激活,可能與其抑制了RⅡα磷酸化有關(guān),CREB的激活主要與PKA的活性相關(guān),與PKC無(wú)關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 張振馨,ZahnerGE,RomanGC,劉君,洪震,屈秋民,劉協(xié)和,張曉君,周玢,武成斌,唐牟尼,洪霞,李輝;中國(guó)北京、西安、上海和成都地區(qū)癡呆亞型患病率的研究[J];中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志;2005年03期

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本文編號(hào)：2603146