【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是以癡呆以及進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。細(xì)胞外不溶性Aβ沉積形成的老年斑(senile plaques,SPs)以及過度磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)等為AD的主要病理標(biāo)志。隨著老年化人口數(shù)量的不斷增長(zhǎng),癡呆癥的患病人數(shù)逐年增加,但是臨床上仍無(wú)有效的治療途徑。長(zhǎng)久以來(lái),“Aβ蛋白級(jí)聯(lián)假說”為AD發(fā)生與發(fā)展提供了主要的依據(jù):不溶性Aβ蛋白在腦中沉積,并逐漸引發(fā)突觸功能障礙、炎癥、神經(jīng)元丟失,最終導(dǎo)致癡呆。D-絲氨酸(D-serine)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞遞質(zhì),并且通過作用于NMDAR的甘氨酸(Gly)位點(diǎn),或者通過參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)發(fā)揮其對(duì)應(yīng)的作用。D-serine對(duì)于改善大鼠的認(rèn)知功能及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有顯著療效,但其療效的具體作用機(jī)制仍不明確。D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)是D-serine的氧化酶,在體內(nèi)能夠起到代謝D-serine的作用;苯甲酸鈉(Sodium benzoate,BE)是DAAO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,通過與其活性中心相結(jié)合起到抑制DAAO的作用。本實(shí)驗(yàn)通過DAAO與BE對(duì)D-serine的作用,從兩個(gè)方面探討D-serine對(duì)Aβ_(1-42)誘導(dǎo)的AD模型小鼠學(xué)習(xí),記憶及認(rèn)知功能的改變情況與其可能的作用機(jī)制,為D-serine改善AD提供理論依據(jù)。研究目的:本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)D-serine對(duì)由β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的AD模型小鼠認(rèn)知障礙的改變情況,探討D-serine對(duì)于AD的改善作用與其作用機(jī)制,旨在為臨床上AD的預(yù)防及改善提供一定的理論依據(jù)。研究方法:1、42只SPF級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為6組,包括對(duì)照組(Control),假手術(shù)組(Sham),Aβ組(Aβ),Aβ+D-serine組(Aβ+D-serine),Aβ+DAAO組(Aβ+DAAO),Aβ+BE組(Aβ+BE),每組7只。之后,模型組小鼠使用腦立體定位儀于雙側(cè)海馬CA1區(qū)微量注射Aβ_(1-42)(2μl,2.0μg/μl)。假手術(shù)組小鼠海馬相同位置注射等量生理鹽水。造模后兩天,模型組小鼠分別腹腔注射10天生理鹽水、D-serine(30 mg/kg)、DAAO(30 mg/kg)、BE(30 mg/kg),正常組不做任何處理。2、小鼠腹腔注射給藥后進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)(新物體識(shí)別試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn))用以分析給藥D-serine對(duì)各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶以及認(rèn)知功能的影響。3、使用銀染法檢測(cè)各組小鼠海馬區(qū)外源性Aβ沉積的分布以及表達(dá)變化情況。4、使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠海馬區(qū)Aβ,GFAP,TNF-α,NMDAR1,p-JNK,p-c-Jun,ATF2以及IL-1β,p-MAPT(S404),p-GSK3β陽(yáng)性表達(dá)情況。5、Western blot方法檢測(cè)海馬區(qū)GFAP,TNF-α,NMDAR1,p-JNK,JNK,p-c-Jun,c-Jun,ATF2以及IL-1β,p-MAPT(S404),p-GSK3β蛋白表達(dá)的具體變化。研究結(jié)果:1、行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示:(a)新物體識(shí)別試驗(yàn):對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠認(rèn)知指數(shù)無(wú)顯著性差異(P0.05),而Aβ組小鼠認(rèn)知指數(shù)顯著降低(P0.01);與Aβ組相比,Aβ+D-serine組小鼠認(rèn)知指數(shù)明顯升高(P0.01);(b)曠場(chǎng)試驗(yàn):與對(duì)照組相比,Aβ組小鼠運(yùn)動(dòng)總路程以及運(yùn)動(dòng)平均速度明顯降低,站立次數(shù)明顯減少(P0.01);當(dāng)給藥D-serine后,Aβ+D-serine組小鼠運(yùn)動(dòng)總路程和運(yùn)動(dòng)平均速度明顯升高,站立次數(shù)明顯增多(P0.01)。2、銀染法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠海馬區(qū)染色均一,神經(jīng)原纖維排列整齊,密集,未見Aβ沉積形成的黑色斑塊;Aβ組神經(jīng)原纖維纏繞明顯,可見大量Aβ斑塊,分布密集;Aβ+D-serine組可見少量Aβ斑塊,分布稀疏。3、免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,Aβ組GFAP,TNF-α,p-JNK,p-c-Jun,ATF2,NMDAR1以及IL-1β,p-MAPT(S404)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(P0.01),而p-GSK3β陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P0.01);而與Aβ組相比,Aβ+D-serine組GFAP,TNF-α,p-JNK,p-c-Jun,ATF2,NMDAR1以及IL-1β,p-MAPT(S404)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P0.01),p-GSK3β陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(P0.01)。4、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。研究結(jié)論:1、小鼠海馬CA1區(qū)微量注射Aβ_(1-42)可產(chǎn)生AD樣病理改變以及使小鼠學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能障礙。2、D-serine能夠改善Aβ誘導(dǎo)的小鼠記憶以及認(rèn)知功能障礙。3、D-serine處理后可能通過(a):作用于NMDAR的Gly位點(diǎn)抑制JNK信號(hào)通路從而改善AD模型小鼠認(rèn)知障礙;(b):作用于GSK3β信號(hào)通路抑制tau蛋白的過度磷酸化。
【圖文】：

圖 2-1 臺(tái)盼藍(lán)染色Fig. 2-1 Trypan Blue Staining.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理42 只 SPF 級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為 6 組，每組 7 只；包括對(duì)照組（Contro術(shù)組（Sham），Aβ組（Aβ），Aβ + D-serine 組（Aβ + D-serine），Aβ + DAβ + DAAO），Aβ+ BE 組（Aβ + BE）。之后 Aβ、Aβ + D-serine、Aβ + DA + BE 組小鼠使用微量進(jìn)樣器于雙側(cè)海馬 CA1 區(qū)微量注射 Aβ1-42（2.0 μg 2 μl；假手術(shù)組小鼠雙側(cè)海馬微量注射等量生理鹽水。造模兩天后分別 10 天生理鹽水、D-serine（30 mg/kg）、DAAO（30 mg/kg）、BE（30 m2]。.4 新物體識(shí)別試驗(yàn)新物體識(shí)別試驗(yàn)(New Object Recognition Test, NOR)在第 14 天（如圖 。此試驗(yàn)分為三個(gè)階段并于三天內(nèi)進(jìn)行。第一天為適應(yīng)階段，將小鼠

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文小鼠的探索行為定義為其用前爪探索或者鼻子嗅物體的距離小于 2 cm，依靠物體或者在物體上休息則不視為探索行為。認(rèn)知指數(shù)計(jì)算公式為：認(rèn)知指數(shù)=探索新物體的時(shí)間/（探索新物體的時(shí)間+探索舊物體的時(shí)間）（RI=Tn/（Tf+Tn））[53]。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2602535