【摘要】：目的建立阿爾茨海默病(AD)體外疾病模型,篩選小分子化合物及研究相關(guān)藥物靶點的作用機制。方法通過應(yīng)用β-淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)對人誘導(dǎo)性多潛能干細胞(hi PSCs)來源的神經(jīng)元的毒性作用來模擬AD,并應(yīng)用該模型進行藥物篩選;通過檢測細胞活力,細胞免疫熒光,蛋白免疫印記及實時定量PCR等方法研究Aβ1-42毒性作用機制及和相關(guān)治療性藥物的作用機制。結(jié)果1)本研究所采用的商業(yè)化神經(jīng)元(i Cell#174;Neurons)來源于hi PSCs,是高度純化的神經(jīng)元,其中Tu J1(+)/Nestin(-)細胞的比例為98.41%;i Cell Neurons具有前腦特性,其中主要為GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元;i Cell Neurons復(fù)蘇后可以逐漸形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),并具有電生理活性。2)Aβ1-42對i Cell Neurons具有毒性作用:可降低其細胞活力,抑制神經(jīng)突的發(fā)生,誘導(dǎo)細胞凋亡及最終導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失。3)應(yīng)用該種細胞毒性模型進行小分子化合物篩選,在354個化合物中發(fā)現(xiàn)了幾19個可以對抗Aβ1-42毒性作用的小分子,其中有一個為細胞周期素依賴性激酶2(Cdk2)抑制劑;進一步篩選了一系列商業(yè)化的針對不同Cdk亞型的Cdk抑制劑,結(jié)果表明Cdk2抑制劑的確具有很強的保護神經(jīng)元對抗Aβ1-42毒性的作用。4)我們發(fā)現(xiàn)Aβ1-42的神經(jīng)毒性作用與細胞周期事件(CCEs)的發(fā)生密切相關(guān):Aβ1-42可以誘導(dǎo)i Cell Neurons重新進入細胞周期S期(DNA合成期)并隨后發(fā)生凋亡;Aβ1-42還可以誘導(dǎo)Cyclin D1,phos-Rb,E2F1,Cyclin A和Cdk2等細胞周期蛋白的表達增加。5)Cdk2小分子抑制劑可以抑制CCEs的發(fā)生,例如:Cdk2抑制劑GW8510可以阻止Aβ1-42引起的Cyclin D1和phos-Rb表達的升高。6)應(yīng)用針對Cdk2小分子抑制劑或sh RNA可以保護i Cell Neurons對抗Aβ1-42毒性作用。7)成功誘導(dǎo)hi PS-C4(另一個hi PS細胞株)分化成前腦神經(jīng)元,并且這些神經(jīng)元對Aβ1-42毒性作用敏感。8)與i Cell Neurons中的現(xiàn)象類似,Aβ1-42可以誘導(dǎo)hi PS-C4來源的神經(jīng)元重新進入細胞周期S期并隨后發(fā)生凋亡;此外,Aβ1-42還可以誘導(dǎo)Cdk4,Cyclin D1,Cdk2和phos-Rb等細胞周期蛋白在細胞內(nèi)的位置發(fā)生變化。9)Cdk2抑制劑保護hi PS-C4來源的神經(jīng)元對抗Aβ1-42的毒性作用,包括阻止其細胞活力的下降和神經(jīng)元的凋亡及丟失。9)在人胚胎干細胞(H9 ES)來源的前腦神經(jīng)元中再次證實了Aβ1-42的神經(jīng)毒性作用和Cdk2抑制劑的保護作用。結(jié)論本研究第一次展示了Aβ1-42對hi PSCs來源的神經(jīng)元具有毒性作用,并應(yīng)用該細胞模型進行了藥物篩選;我們發(fā)現(xiàn)Aβ1-42毒性與細胞周期事件密切相關(guān),并且Cdk2抑制劑可以保護神經(jīng)元對抗Aβ1-42的毒性作用;本研究為如何應(yīng)用hi PSCs建立神經(jīng)退行性疾病的體外細胞模型及高通量藥物篩選平臺提供了一個很好的案例。
【圖文】：

圖 1 iCell Neurons 中神經(jīng)元比例檢測A）神經(jīng)元標志物：TuJ1，綠色；細胞核染色：Hoechst，藍色。B) FACS:熒光激活細胞分選技術(shù)；Nestin 為神經(jīng)前體細胞標志物；；標尺，50 微米。Fig.1 Detecting the ratio of neurons in iCell NeuronsA) Neuronal marker: TuJ1, green; Nuclei staining: Hoechst, blue. B) FACS: fluorescence

圖 2 iCell Neurons 內(nèi)腦區(qū)域和神經(jīng)功能標志物的表達和 B）用 MAP2（綠色），GABA（紅色），，vGAT（綠色）和 vGLUT2（紅色）標 14 天的 iCell Neurons；用 Hoechst（藍色）標記細胞核；標尺，50 微米。C）復(fù)蘇天神經(jīng)元的實時定量 PCR 結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

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本文編號：2575003