【摘要】：目的建立阿爾茨海默病(AD)體外疾病模型,篩選小分子化合物及研究相關(guān)藥物靶點(diǎn)的作用機(jī)制。方法通過應(yīng)用β-淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)對(duì)人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(hi PSCs)來源的神經(jīng)元的毒性作用來模擬AD,并應(yīng)用該模型進(jìn)行藥物篩選;通過檢測(cè)細(xì)胞活力,細(xì)胞免疫熒光,蛋白免疫印記及實(shí)時(shí)定量PCR等方法研究Aβ1-42毒性作用機(jī)制及和相關(guān)治療性藥物的作用機(jī)制。結(jié)果1)本研究所采用的商業(yè)化神經(jīng)元(i Cell#174;Neurons)來源于hi PSCs,是高度純化的神經(jīng)元,其中Tu J1(+)/Nestin(-)細(xì)胞的比例為98.41%;i Cell Neurons具有前腦特性,其中主要為GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元;i Cell Neurons復(fù)蘇后可以逐漸形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),并具有電生理活性。2)Aβ1-42對(duì)i Cell Neurons具有毒性作用:可降低其細(xì)胞活力,抑制神經(jīng)突的發(fā)生,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及最終導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失。3)應(yīng)用該種細(xì)胞毒性模型進(jìn)行小分子化合物篩選,在354個(gè)化合物中發(fā)現(xiàn)了幾19個(gè)可以對(duì)抗Aβ1-42毒性作用的小分子,其中有一個(gè)為細(xì)胞周期素依賴性激酶2(Cdk2)抑制劑;進(jìn)一步篩選了一系列商業(yè)化的針對(duì)不同Cdk亞型的Cdk抑制劑,結(jié)果表明Cdk2抑制劑的確具有很強(qiáng)的保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗Aβ1-42毒性的作用。4)我們發(fā)現(xiàn)Aβ1-42的神經(jīng)毒性作用與細(xì)胞周期事件(CCEs)的發(fā)生密切相關(guān):Aβ1-42可以誘導(dǎo)i Cell Neurons重新進(jìn)入細(xì)胞周期S期(DNA合成期)并隨后發(fā)生凋亡;Aβ1-42還可以誘導(dǎo)Cyclin D1,phos-Rb,E2F1,Cyclin A和Cdk2等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)增加。5)Cdk2小分子抑制劑可以抑制CCEs的發(fā)生,例如:Cdk2抑制劑GW8510可以阻止Aβ1-42引起的Cyclin D1和phos-Rb表達(dá)的升高。6)應(yīng)用針對(duì)Cdk2小分子抑制劑或sh RNA可以保護(hù)i Cell Neurons對(duì)抗Aβ1-42毒性作用。7)成功誘導(dǎo)hi PS-C4(另一個(gè)hi PS細(xì)胞株)分化成前腦神經(jīng)元,并且這些神經(jīng)元對(duì)Aβ1-42毒性作用敏感。8)與i Cell Neurons中的現(xiàn)象類似,Aβ1-42可以誘導(dǎo)hi PS-C4來源的神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期S期并隨后發(fā)生凋亡;此外,Aβ1-42還可以誘導(dǎo)Cdk4,Cyclin D1,Cdk2和phos-Rb等細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置發(fā)生變化。9)Cdk2抑制劑保護(hù)hi PS-C4來源的神經(jīng)元對(duì)抗Aβ1-42的毒性作用,包括阻止其細(xì)胞活力的下降和神經(jīng)元的凋亡及丟失。9)在人胚胎干細(xì)胞(H9 ES)來源的前腦神經(jīng)元中再次證實(shí)了Aβ1-42的神經(jīng)毒性作用和Cdk2抑制劑的保護(hù)作用。結(jié)論本研究第一次展示了Aβ1-42對(duì)hi PSCs來源的神經(jīng)元具有毒性作用,并應(yīng)用該細(xì)胞模型進(jìn)行了藥物篩選;我們發(fā)現(xiàn)Aβ1-42毒性與細(xì)胞周期事件密切相關(guān),并且Cdk2抑制劑可以保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗Aβ1-42的毒性作用;本研究為如何應(yīng)用hi PSCs建立神經(jīng)退行性疾病的體外細(xì)胞模型及高通量藥物篩選平臺(tái)提供了一個(gè)很好的案例。
【圖文】：

圖 1 iCell Neurons 中神經(jīng)元比例檢測(cè)A）神經(jīng)元標(biāo)志物：TuJ1，綠色；細(xì)胞核染色：Hoechst，藍(lán)色。B) FACS:熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)；Nestin 為神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物；；標(biāo)尺，50 微米。Fig.1 Detecting the ratio of neurons in iCell NeuronsA) Neuronal marker: TuJ1, green; Nuclei staining: Hoechst, blue. B) FACS: fluorescence

圖 2 iCell Neurons 內(nèi)腦區(qū)域和神經(jīng)功能標(biāo)志物的表達(dá)和 B）用 MAP2（綠色），GABA（紅色），，vGAT（綠色）和 vGLUT2（紅色）標(biāo) 14 天的 iCell Neurons；用 Hoechst（藍(lán)色）標(biāo)記細(xì)胞核；標(biāo)尺，50 微米。C）復(fù)蘇天神經(jīng)元的實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2575003