【摘要】：研究背景 Humanin (HN,腦神經(jīng)肽)是由日本學者Hashimoto在對AD患者枕葉進行DNA功能檢測時發(fā)現(xiàn)的一個由24個氨基酸殘基組成的(Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala)線性多肽家族,已被體外證明對AD(阿爾茲海默氏病)神經(jīng)毒性Aβ多肽及β-淀粉樣前體蛋白誘導的神經(jīng)元細胞壞死具有保護作用。 Rattin是在鼠類體內發(fā)現(xiàn)一種新型的編碼38個殘基的分泌性腦神經(jīng)肽類似物(比人類腦神經(jīng)肽Humanin長14個殘基),與人類腦神經(jīng)肽有73%的一致性,Caricasole A等研究認為Rattin能對抗Aβ淀粉樣蛋白誘導的神經(jīng)細胞毒性及家族性阿爾茨海默病的基因突變,具有抗細胞凋亡作用,且能更有效地對抗NMDA誘導的興奮性神經(jīng)元損傷,Rattin的識別鑒定可能是藥理學治療的新途徑,其目的旨在提高內源性腦神經(jīng)肽樣類似物的產(chǎn)生。 血管性認知功能損害是指由各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的一種獲得性智能損害綜合征,是一種慢性的進行性疾病,已成為繼阿爾茨海默病(AD)后的第二大癡呆疾病�；旌闲园V呆既阿爾茨海默氏病(AD)合并血管性癡呆,臨床上并不少見。最近的研究表明,血管性癡呆和AD占據(jù)相同的頻譜的兩端,兩者存在共同的血管因素和重疊的臨床和病理生理特點。國內外實驗證實HN及其衍生物具有潛在的抗細胞凋亡和神經(jīng)保護活性,拮抗NMDA的神胞毒性作用,且對調節(jié)膽堿能系統(tǒng)具有巨大的潛力,對AD,急性缺血性再灌注損傷及藥物所致認知功能損傷具有神經(jīng)保護作用。經(jīng)文獻檢索目前HN類似物對慢性腦缺血灌注不良所致血管性認知缺損的研究未見報道,因此我們首次檢測HN類似物Rattin在慢性腦血管缺血致認知功能損害大鼠海馬和皮層的表達,以證實其對慢性血管性認知損害可能產(chǎn)生的影響。 目的 通過檢測一種新型的HN衍生物Rattin基因及蛋白質在血管性癡呆大鼠腦內的表達,探討Rattin的表達及其對對認知功能損害可能產(chǎn)生的影響。 材料和方法 1.動物模型的制備 1.1實驗動物Animals健康中年雄性SD大鼠30只,體重260-300g,由中國山東中醫(yī)藥大學動物中心提供。隨機分為假手術組12只(sham-operated group, SOG),手術組18只(VD model group, MDG)。雙側頸總動脈永久性結扎術(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO)為國際公認血管性癡呆模型常用方法,我們采用BCCAO制備血管性癡呆模型,模擬慢性腦低灌注狀態(tài)下的認知功能損害。具體操作方法：10%水合氯醛(0.30ml/100g)腹腔注射麻醉,頸前部去毛,消毒后沿腹側頸正中切開,氣管旁分離出雙側頸總動脈,以“0”號線雙重結扎頸總動脈。SOG組動物行頸前切開,分離但不結扎頸總動脈。 1.2大鼠空間學習記憶能力測試 術前1天及術后第31天,采用Morris水迷宮實驗測試大鼠的空間學習記憶能力。Morris水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計并應用于檢測大鼠空間學習記憶的常用裝置,分為定位航行實驗及空間探索實驗兩部分,參照有關文獻方法于泰山醫(yī)學院動物實驗中心完成測試。 1.3行為學測試結果 統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,組間比較采用t檢驗,所有數(shù)據(jù)采用運用SPSS13醫(yī)學統(tǒng)計學軟件處理。 應用水迷宮實驗對兩組大鼠學習記憶成績進行比較,結果表明MDG組大鼠的逃避潛伏期較SOG組明顯延長(P0.01), MDG組大鼠的跨平臺次數(shù)較SOG組明顯減少(P0.01)。說明MDG大鼠學習記憶能力降低,造模成功。 1.4大鼠標本的取材 大鼠模型制作及分組成功,1月取材,用10%水合氯醛0.35ml/100g麻醉大鼠,,常規(guī)胸腹聯(lián)合切口,經(jīng)左心室插管,分別用生理鹽水、4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液灌注固定,將大鼠斷頭處死,標記標本的組別和時間點。,隨機抽取模型組6只,假手術組6只,從視交叉處向后將大腦切成約3mm厚的薄片,梯度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋,以備Nissl染色使用。剩余模型組6只,假手術組6只大鼠迅速分離腦組織,剝取海馬,枕葉及顳葉皮層置液氮中,于-80℃低溫冰箱保存,分別用于組織總RNA及總蛋白的提取,備real time-qRT-PCR, Westernblotting使用。 1.5病理學觀察：Nissl染色 取鼠海馬及顳葉皮層腦切片,依次放入二甲苯和梯度酒精中脫蠟,PBS (0.01mol/L, pH7.4)洗滌后,放入1%的甲苯胺藍染液中染色數(shù)分鐘。染色后經(jīng)95%酒精快速分化,二甲苯透明,最后用中性樹脂封片。 光學顯微鏡下觀察大鼠海馬和顳葉皮層細胞,可見神經(jīng)元內Nissl體染色呈紫蘭色。模型組癡呆大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞層次減少,排列稀疏,胞漿內尼氏體消失,細胞核體積變小,深染,結構不清,呈核固縮表現(xiàn),神經(jīng)纖維排列紊亂；假手術組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞2-3層,排列緊密,細胞核圓而大,核仁清晰,胞漿內尼氏體豐富,神經(jīng)纖維密集,排列整齊；假手術組大鼠顳葉皮層錐體細胞形態(tài)正常、結構清晰、Nissl體含量豐富；模型組癡呆大鼠顳葉皮層神經(jīng)細胞核固縮,局限性神經(jīng)元數(shù)目減少,膠質細胞增生。 2.試驗方法 2.1檢測Rattin蛋白在大鼠不同腦區(qū)的的表達Western blot分別檢測兩組大鼠海馬,顳葉和枕葉皮層三個部位Rattin蛋白的表達。Rattin蛋白檢測：提取Lowry法測蛋白含量。采用Western印跡方法檢測Rattin蛋白的相對含量。用凝膠成像分析儀采集圖像并用軟件進行分析。GAPDH作內參照。操作步驟：(1)組織總蛋白樣品的制備(2)細胞總蛋白樣品的定量(3)SDS-PAGE凝膠電泳(4)轉膜(5)免疫反應(6)膜重新雜交內參GADPH 2.2檢測Rattin基因在大鼠海馬,顳葉和枕葉皮層的表達實時熒光定量PCR分別檢測兩組大鼠海馬,顳葉和枕葉皮層三個部位Rattin基因的表達。 RattinmRNA檢測方法：用Trizol法提取總RNA; RNA鑒定和定量；反轉錄反應；PCR反應；取目的基因和GAPDH的PCR產(chǎn)物各5μl,2%瓊脂糖凝膠電泳。全自動凝膠成像分析系統(tǒng)照相得到目的基因與GAPDH的擴增產(chǎn)物的積分光密度值(Ⅰ),計算二者的比值(Ⅰ目的基因/IGAPDH),以此作為目的基因的相對表達量。 操作步驟：(1)組織總RNA提取(2)反轉錄反應：RNA反轉錄成cDNA (3)PCR擴增cDNA:Rattin and β-actin的引物序列：Rattinl5'-TTAGGGACTAGAATGAATGG-3';Rattin25'-AACTAGTAAATTGAAGCTCC-3'; β-actin a,5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'; β-actin b,5'-TCTGCTGGAAGGTGGACAGT-3。 配制PCR反應液(反應液配制請在冰上進行)；三步法PCR；融解曲線方法：相對定量；數(shù)據(jù)處理方法：2-ΔΔC(t) 2.3統(tǒng)計學處理：應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組間均值的比較用SNK法單因素方差分析。 結果 1.模型組(MDG)與假手術組(SOG)Rattin蛋白表達量比較MDG組大鼠顳葉及枕葉皮層Rattin蛋白表達量與對照SOG組比較未見明顯差異(P0.05,P0.05); MDG組大鼠海馬與顳葉及枕葉皮層Rattin蛋白表達量對比明顯增高(P0.01,P0.01); SOG組大鼠海馬與顳葉及枕葉皮層之間Rattin蛋白表達量比較明顯降低P0.01,P0.01), SOG組大鼠顳葉及枕葉皮層之間Rattin蛋白表達量比較未見明顯差異(P0.05)。 2.模型組與假手術組Rattin基因表達量比較模型組(MDG)與假手術組(SOG)之比結果分析采用2-ΔC(t)方法。在基因水平上對Rattin進行定量分析,通過熒光實時PCR檢測顯示：MDG組與對照組顳葉和枕葉Rattin表達比較無顯著差異(P0.05,P0.05); MDG組海馬區(qū)Rattin基因表達量比對照組明顯增高(P0.01)；SOG組海馬與顳葉,枕葉比較Rattin表達有顯著降低(P0.01, P0.01), SOG組顳葉,枕葉間Rattin表達無明顯差異(P0.05)。 討論 近幾年的研究發(fā)現(xiàn)HN類似物Rattin對AD及AD以外的認知功能缺損有神經(jīng)保護作用,其機制可能與抗NMDA毒性,調節(jié)神經(jīng)膽堿乙酰轉移酶和囊泡內乙酰膽堿運載體mRNA表達有關,同時具有調節(jié)氧化應激反應,減少細胞凋亡,保護血管內皮細胞的功能,HN類似物的分泌活性是在其基因序列中進行編碼的,HN必須被分泌到細胞外才能發(fā)揮它的抗AD相關損傷的神經(jīng)保護功能。目前認為人類HN多表達在能量代謝相關的組織,如心臟,骨骼肌,腎臟和肝臟,在免疫系統(tǒng)中幾乎未檢測到,在腦區(qū)小腦和枕葉比其他部位表達更顯著,腦脊髓液,精液和血漿中也見表達。Yun K. Oha發(fā)現(xiàn)在人類乳房內動脈,動脈粥樣硬化的冠狀動脈,大隱靜脈的內皮細胞也可見HN的表達,HN可通過調節(jié)進展斑塊的氧化應激反應和細胞凋亡保護血管內皮細胞功能,防止動脈粥樣硬化斑塊的進展。 Caricasole A報道了鼠類HN類似物基因,命名為rattin (RN),證明Rattin是一種新型種族發(fā)育相關性腦神經(jīng)肽,具有針對Aβ和興奮性神經(jīng)元死亡的保護活性。 我們首次在慢性腦灌注不良所致認知功能損害的大鼠模型海馬,枕葉,顳葉中檢測Rattin的表達,以探討其可能發(fā)生的改變。本實驗通過Western blot, RT-PCR方法檢測HN類似物Rattin蛋白及基因在血管性癡呆大鼠海馬和顳葉,枕葉皮層的表達,首次發(fā)現(xiàn)慢性腦灌注不良致血管性癡呆大鼠海馬Rattin表達顯著增高,而顳葉,枕葉皮層Rattin表達沒有變化,此結果提示海馬神經(jīng)細胞可能通過自身分泌Rattin發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用,Rattin表達增高可能與學習記憶損害有關,這種增高可能是一種反應性神經(jīng)保護作用。海馬神經(jīng)元缺血可致神經(jīng)元皺縮,數(shù)目減少,細胞內胞質貧乏,核糖體、線粒體和內質網(wǎng)數(shù)量減少,胞漿內含有大量溶酶體和細胞絲,突觸前膜或后膜腫脹、空化,由此造成與認知損害有關的神經(jīng)遞質如乙酰膽堿,興奮性氨基酸,神經(jīng)肽等異常,同時激發(fā)Rattin的表達增高。 Terashita K,研究顯示人腦中腦神經(jīng)肽在小腦和枕葉的表達高于其他腦區(qū),正常大鼠各腦區(qū)Rattin在海馬的表達最低,枕葉最高,本實驗大鼠正常對照組海馬,顳葉和枕葉Rattin表達未見顯著差異,另一方面,雙側頸動脈永久性結扎致慢性腦缺血累及海馬,顳葉為主,顳葉皮層受損亦可引起近事記憶缺損,實驗顯示顳葉Rattin表達沒有變化,此結果及機制有待于進一步研究。結論 Rattin作為一種新型腦神經(jīng)肽類似物對慢性缺血性血管性癡呆可能具有一定的神經(jīng)保護活性,此結果為血管性認知缺損發(fā)病機制的研究和藥物治療提供新的方向。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.13

【參考文獻】

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