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噬菌體展示技術(shù)篩選腦靶向功能肽及其修飾納米粒的腦內(nèi)遞藥研究

發(fā)布時間:2019-11-30 18:58
【摘要】:阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)是四大常見的神經(jīng)退行性疾病之一。在65歲以上的人群中,大約10%患有AD。隨著人口老齡化,這一疾病的危害愈加突出;此外AD還逐步呈現(xiàn)年輕化趨勢。AD給患者及家屬的生活質(zhì)量帶來很大影響,同時也給社會帶來很大壓力。AD的治療已成為亟待解決的重要問題。 文獻報道,多種蛋白多肽藥物(如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性纖維生長因子等)具有神經(jīng)保護作用,為神經(jīng)退行性疾病如AD的治療帶來希望。但是,這些多肽蛋白類藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性差,易受酶降解,血中半衰期短;并且由于血腦屏障的存在使得這類藥物難以入腦,不能實現(xiàn)直接給藥用于腦部疾病的治療。因此對于蛋白多肽類藥物腦內(nèi)遞釋的研究具有很高的科學價值和臨床意義。 為了增加藥物透過血腦屏障,目前研究最為關(guān)注,也最具前景的策略是將納米載藥系統(tǒng)經(jīng)受體介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運入腦。但是目前報道的介導(dǎo)入腦的靶向功能基如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和OX26等都存在體內(nèi)內(nèi)源性蛋白飽和及競爭抑制問題,從而影響其介導(dǎo)入腦的效果。為了解決上述難題,本文采用噬菌體展示技術(shù)主動篩選新型的靶向功能基,并獲得對小鼠腦部具有靶向性的噬菌體展示短肽TGN和CTY。該展示短肽具有低免疫原性、高靶向性和易于修飾的優(yōu)點,并可以解決上述內(nèi)源性飽和的問題。將篩選得到的噬菌體展示肽以共價連接的方式修飾到聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)納米粒表面,由此構(gòu)建新型的腦靶向遞藥系統(tǒng)。通過PEG-PLGA納米粒包載蛋白多肽藥物可以保護其不受體內(nèi)環(huán)境降解,提高穩(wěn)定性;納米粒表面修飾的噬菌體展示肽可以發(fā)揮腦靶向作用而介導(dǎo)載藥納米粒入腦,提高對中樞疾病的治療效果。 本文第一部分為噬菌體展示技術(shù)篩選腦靶向功能肽,實驗選擇兩種噬菌體肽庫進行體內(nèi)親和篩選。利用Ph.D.-C7C肽庫,經(jīng)過篩選方式和篩選條件的優(yōu)化,在多輪體內(nèi)親和篩選后獲得五個單克隆噬菌體。其中三個單克隆噬菌體展示相同的序列,為CTSTSAPYC,其重復(fù)率為7.14%;其余兩個單克隆噬菌體展示另一條序列,為CPMKSHTNC,其重復(fù)率為4.76%。將前者命名為Clone7-19,將其展示的基序即CTSTSAPYC命名為CTY肽。同樣,利用Ph.D.-12肽庫篩選獲得一條序列為TGNYKALHPHNG的展示肽,其重復(fù)率高達60%,將其命名為TGN肽,展示TGN肽的噬菌體命名為Clone12-8。CTY連接FITC后(FITC-CTY)的活體分布顯示其具有較好的腦靶向性。Clone12-8在免疫組化小鼠體內(nèi)分布考察和熒光標記后(FITC-TGN)的活體分布結(jié)果顯示也具有良好的腦靶向性。但這兩條展示肽都較易被腎排泄,難以有效發(fā)揮腦靶向效果。 為了使上述展示肽能在體內(nèi)長時間發(fā)揮腦靶向性,第二部分進一步將展示肽與具有體內(nèi)長循環(huán)特性的PEG-PLGA納米粒相結(jié)合,共同構(gòu)建一類新型、高效的腦靶向遞釋系統(tǒng)。第二部分第一章采用乳化/溶媒蒸發(fā)法制備普通納米粒(Nanoparticle, NP),通過納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基團(Maleimide, MAL)與展示肽TGN末端的巰基共價反應(yīng),將展示肽結(jié)合到納米粒表面(TGN-NP),并對TGN-NP制備中的若干條件進行了優(yōu)化,確定以下條件:聚合物加入的總量為每份25mg, MePEG-PLGA與MAL-PEG-PLGA的比例為4:1,馬來酰亞胺基與蛋白巰基的反應(yīng)摩爾比為3:1,兩者的反應(yīng)時間為6-8h。按優(yōu)化工藝制備的TGN-NP粒徑在89nm左右,Zeta電位在—24mV左右,表面連接的TGN數(shù)目在195左右。利用納米粒包載近紅外染料DiR,通過小動物活體成像儀比較了NP、表面低密度修飾的TGN-NP (3:1)、高密度修飾的TGN-NP(1:1)以及高密度修飾的CTY-NP (1:1)尾靜脈注射裸鼠后的活體分布及腦內(nèi)遞藥特性。結(jié)果表明,TGN肽高密度修飾的納米粒具有較好的腦靶向性,且顯著優(yōu)于CTY肽高密度修飾納米粒、TGN肽低密度修飾納米粒及NP,其能有效增加納米粒的入腦量,而一定程度減少肝、腎等組織中的納米粒聚集,有望作為腦靶向功能基介導(dǎo)更多藥物入腦。 第二部分第二章對TGN-NP的腦內(nèi)遞藥特性和毒性進行了體外評價。制備了載香豆素-6的NP和TGN-NP,體外泄漏實驗證明,包載在NP和TGN-NP中的香豆素-6在pH4.0和pH7.4介質(zhì)中的泄漏率均較低,提示可用于示蹤納米粒的體外行為。bEnd.3細胞攝取載香豆素-6的NP和TGN-NP的定性觀察結(jié)果顯示,在30、60、120min時,細胞對TGN-NP的攝取均顯著高于NP。定量實驗結(jié)果表明,bEnd.3細胞在不同納米粒濃度、不同溫度及不同時間條件下對TGN-NP的攝取均顯著高于NP,且TGN-NP的攝取呈現(xiàn)時間、濃度和溫度依賴性。說明bEnd.3細胞對于TGN-NP的攝取是一個主動轉(zhuǎn)運過程。胞吞抑制實驗提示,TGN肽對TGN-NP胞吞轉(zhuǎn)運起著競爭抑制作用,TGN-NP主要通過穴樣凹陷和巨胞飲兩條途徑被bEnd.3細胞內(nèi)吞,并且該過程為高爾基體和溶酶體參與的能量依賴過程。細胞活力測定結(jié)果顯示,在0.1~10mg/mL的濃度范圍內(nèi), NP、TGN-NP和TGN為RGR的0~1級,具有良好的安全性。TGN-NP是一種有效、低毒的腦靶向藥物遞釋系統(tǒng)。 第二部分第三章對TGN-NP的腦內(nèi)遞藥特性進行了體內(nèi)評價。建立了香豆素-6全血樣品、組織樣品測定方法,該方法專屬性強,標準曲線的線性關(guān)系良好,精密度、回收率符合生物樣品測定要求。小鼠尾靜脈注射載香豆素-6的TGN-NP(劑量為50μg/kg香豆素-6)1h后腦切片的結(jié)果顯示,TGN-NP在第三腦室、皮層及海馬區(qū)域的分布均顯著高于NP。以香豆素-6作為熒光探針,以NP作對照,采用藥動學方法考察了TGN-NP (3:1)和TGN-NP (1:1)的腦內(nèi)遞藥特性,ICR小鼠尾靜脈注射TGN-NP (3:1)和TGN-NP (1:1)的腦靶向指數(shù)分別為2.83和3.78,腦靶向效果良好:TGN肽的修飾能有效提高納米粒的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運。其他組織的分布結(jié)果表明,NP和TGN-NP主要分布在脾,其次是肝和肺。CD68細胞染色的急性毒性實驗結(jié)果顯示,高劑量(18Qmg/kg)的TGN-NP不會引起B(yǎng)alb/c鼠大腦、小腦、心和肺的巨噬細胞增多,僅對肝和腎產(chǎn)生短暫的、一過性的輕微毒性,低劑量的TGN-NP不會引起脾的急性毒性反應(yīng)。 第二部分第四章將TGN-NP包載具有神經(jīng)保護作用的多肽藥物NAP,研究其用于多肽蛋白藥物腦內(nèi)遞送的可行性。采用復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法制備載多肽藥物NAP的NP (NP/NAP);與TGN肽共價連接后制備載NAP的TGN-NP (TGN-NP/NAP);其粒徑均在150nm左右,Zeta電位約為一19mV。采用雙側(cè)海馬定位注射Aβ1-40聚集肽構(gòu)建小鼠AD模型,通過Morris水迷宮實驗評價NAP制劑對于小鼠學習能力及空間記憶障礙的治療和改善作用。通過測定小鼠腦皮層與海馬中乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力以及病理切片評價NAP制劑對中樞膽堿能神經(jīng)元的保護作用。根據(jù)行為學研究、生化指標和病理切片結(jié)果,NAP溶液直接靜脈注射或是皮下注射對于Aβ1-40所致小鼠老年性癡呆無改善作用,即使皮下注射劑量提高5倍(10μg/kg),對記憶能力及生化指標等的改善作用仍然不夠理想。將NAP包載入NP后,能提高NAP在動物體內(nèi)的穩(wěn)定性,因此一定程度上改善小鼠的空間記憶障礙,但是NP/NAP在高劑量時(4μg/kg)仍未能使Aβ140所致小鼠老年性癡呆的記憶能力及生化指標恢復(fù)至正常水平。而將包載NAP的納米粒表面修飾TGN后,能夠顯著提高NAP腦內(nèi)遞送的效率,在劑量比NAP溶液靜脈注射及皮下注射低一倍的情況下(1μg/kg),已經(jīng)能夠產(chǎn)生明顯的空間記憶改善作用,而將劑量提至2μg/kg和4μg/kg時,能顯著降低小鼠大腦皮層與海馬區(qū)的乙酰膽堿酯酶含量,提高乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶含量,各項指標與正常對照小鼠無顯著性差異。說明TGN-NP能夠高效遞送NAP等體內(nèi)穩(wěn)定性差、難以透過血腦屏障的蛋白多肽藥物,具有良好的腦靶向性,有望顯著提高對AD治療效果。
【學位授予單位】:復(fù)旦大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2012
【分類號】:R749.16

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本文編號:2568029

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