【摘要】：阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)是四大常見的神經(jīng)退行性疾病之一。在65歲以上的人群中,大約10%患有AD。隨著人口老齡化,這一疾病的危害愈加突出；此外AD還逐步呈現(xiàn)年輕化趨勢。AD給患者及家屬的生活質(zhì)量帶來很大影響,同時也給社會帶來很大壓力。AD的治療已成為亟待解決的重要問題。 文獻報道,多種蛋白多肽藥物(如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性纖維生長因子等)具有神經(jīng)保護作用,為神經(jīng)退行性疾病如AD的治療帶來希望。但是,這些多肽蛋白類藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性差,易受酶降解,血中半衰期短；并且由于血腦屏障的存在使得這類藥物難以入腦,不能實現(xiàn)直接給藥用于腦部疾病的治療。因此對于蛋白多肽類藥物腦內(nèi)遞釋的研究具有很高的科學價值和臨床意義。 為了增加藥物透過血腦屏障,目前研究最為關(guān)注,也最具前景的策略是將納米載藥系統(tǒng)經(jīng)受體介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運入腦。但是目前報道的介導(dǎo)入腦的靶向功能基如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和OX26等都存在體內(nèi)內(nèi)源性蛋白飽和及競爭抑制問題,從而影響其介導(dǎo)入腦的效果。為了解決上述難題,本文采用噬菌體展示技術(shù)主動篩選新型的靶向功能基,并獲得對小鼠腦部具有靶向性的噬菌體展示短肽TGN和CTY。該展示短肽具有低免疫原性、高靶向性和易于修飾的優(yōu)點,并可以解決上述內(nèi)源性飽和的問題。將篩選得到的噬菌體展示肽以共價連接的方式修飾到聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)納米粒表面,由此構(gòu)建新型的腦靶向遞藥系統(tǒng)。通過PEG-PLGA納米粒包載蛋白多肽藥物可以保護其不受體內(nèi)環(huán)境降解,提高穩(wěn)定性；納米粒表面修飾的噬菌體展示肽可以發(fā)揮腦靶向作用而介導(dǎo)載藥納米粒入腦,提高對中樞疾病的治療效果。 本文第一部分為噬菌體展示技術(shù)篩選腦靶向功能肽,實驗選擇兩種噬菌體肽庫進行體內(nèi)親和篩選。利用Ph.D.-C7C肽庫,經(jīng)過篩選方式和篩選條件的優(yōu)化,在多輪體內(nèi)親和篩選后獲得五個單克隆噬菌體。其中三個單克隆噬菌體展示相同的序列,為CTSTSAPYC,其重復(fù)率為7.14%；其余兩個單克隆噬菌體展示另一條序列,為CPMKSHTNC,其重復(fù)率為4.76%。將前者命名為Clone7-19,將其展示的基序即CTSTSAPYC命名為CTY肽。同樣,利用Ph.D.-12肽庫篩選獲得一條序列為TGNYKALHPHNG的展示肽,其重復(fù)率高達60%,將其命名為TGN肽,展示TGN肽的噬菌體命名為Clone12-8。CTY連接FITC后(FITC-CTY)的活體分布顯示其具有較好的腦靶向性。Clone12-8在免疫組化小鼠體內(nèi)分布考察和熒光標記后(FITC-TGN)的活體分布結(jié)果顯示也具有良好的腦靶向性。但這兩條展示肽都較易被腎排泄,難以有效發(fā)揮腦靶向效果。 為了使上述展示肽能在體內(nèi)長時間發(fā)揮腦靶向性,第二部分進一步將展示肽與具有體內(nèi)長循環(huán)特性的PEG-PLGA納米粒相結(jié)合,共同構(gòu)建一類新型、高效的腦靶向遞釋系統(tǒng)。第二部分第一章采用乳化/溶媒蒸發(fā)法制備普通納米粒(Nanoparticle, NP),通過納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基團(Maleimide, MAL)與展示肽TGN末端的巰基共價反應(yīng),將展示肽結(jié)合到納米粒表面(TGN-NP),并對TGN-NP制備中的若干條件進行了優(yōu)化,確定以下條件：聚合物加入的總量為每份25mg, MePEG-PLGA與MAL-PEG-PLGA的比例為4：1,馬來酰亞胺基與蛋白巰基的反應(yīng)摩爾比為3：1,兩者的反應(yīng)時間為6-8h。按優(yōu)化工藝制備的TGN-NP粒徑在89nm左右,Zeta電位在—24mV左右,表面連接的TGN數(shù)目在195左右。利用納米粒包載近紅外染料DiR,通過小動物活體成像儀比較了NP、表面低密度修飾的TGN-NP (3:1)、高密度修飾的TGN-NP(1：1)以及高密度修飾的CTY-NP (1:1)尾靜脈注射裸鼠后的活體分布及腦內(nèi)遞藥特性。結(jié)果表明,TGN肽高密度修飾的納米粒具有較好的腦靶向性,且顯著優(yōu)于CTY肽高密度修飾納米粒、TGN肽低密度修飾納米粒及NP,其能有效增加納米粒的入腦量,而一定程度減少肝、腎等組織中的納米粒聚集,有望作為腦靶向功能基介導(dǎo)更多藥物入腦。 第二部分第二章對TGN-NP的腦內(nèi)遞藥特性和毒性進行了體外評價。制備了載香豆素-6的NP和TGN-NP,體外泄漏實驗證明,包載在NP和TGN-NP中的香豆素-6在pH4.0和pH7.4介質(zhì)中的泄漏率均較低,提示可用于示蹤納米粒的體外行為。bEnd.3細胞攝取載香豆素-6的NP和TGN-NP的定性觀察結(jié)果顯示,在30、60、120min時,細胞對TGN-NP的攝取均顯著高于NP。定量實驗結(jié)果表明,bEnd.3細胞在不同納米粒濃度、不同溫度及不同時間條件下對TGN-NP的攝取均顯著高于NP,且TGN-NP的攝取呈現(xiàn)時間、濃度和溫度依賴性。說明bEnd.3細胞對于TGN-NP的攝取是一個主動轉(zhuǎn)運過程。胞吞抑制實驗提示,TGN肽對TGN-NP胞吞轉(zhuǎn)運起著競爭抑制作用,TGN-NP主要通過穴樣凹陷和巨胞飲兩條途徑被bEnd.3細胞內(nèi)吞,并且該過程為高爾基體和溶酶體參與的能量依賴過程。細胞活力測定結(jié)果顯示,在0.1～10mg/mL的濃度范圍內(nèi), NP、TGN-NP和TGN為RGR的0～1級,具有良好的安全性。TGN-NP是一種有效、低毒的腦靶向藥物遞釋系統(tǒng)。 第二部分第三章對TGN-NP的腦內(nèi)遞藥特性進行了體內(nèi)評價。建立了香豆素-6全血樣品、組織樣品測定方法,該方法專屬性強,標準曲線的線性關(guān)系良好,精密度、回收率符合生物樣品測定要求。小鼠尾靜脈注射載香豆素-6的TGN-NP(劑量為50μg/kg香豆素-6)1h后腦切片的結(jié)果顯示,TGN-NP在第三腦室、皮層及海馬區(qū)域的分布均顯著高于NP。以香豆素-6作為熒光探針,以NP作對照,采用藥動學方法考察了TGN-NP (3:1)和TGN-NP (1:1)的腦內(nèi)遞藥特性,ICR小鼠尾靜脈注射TGN-NP (3:1)和TGN-NP (1:1)的腦靶向指數(shù)分別為2.83和3.78,腦靶向效果良好：TGN肽的修飾能有效提高納米粒的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運。其他組織的分布結(jié)果表明,NP和TGN-NP主要分布在脾,其次是肝和肺。CD68細胞染色的急性毒性實驗結(jié)果顯示,高劑量(18Qmg/kg)的TGN-NP不會引起B(yǎng)alb/c鼠大腦、小腦、心和肺的巨噬細胞增多,僅對肝和腎產(chǎn)生短暫的、一過性的輕微毒性,低劑量的TGN-NP不會引起脾的急性毒性反應(yīng)。 第二部分第四章將TGN-NP包載具有神經(jīng)保護作用的多肽藥物NAP,研究其用于多肽蛋白藥物腦內(nèi)遞送的可行性。采用復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法制備載多肽藥物NAP的NP (NP/NAP);與TGN肽共價連接后制備載NAP的TGN-NP (TGN-NP/NAP);其粒徑均在150nm左右,Zeta電位約為一19mV。采用雙側(cè)海馬定位注射Aβ1-40聚集肽構(gòu)建小鼠AD模型,通過Morris水迷宮實驗評價NAP制劑對于小鼠學習能力及空間記憶障礙的治療和改善作用。通過測定小鼠腦皮層與海馬中乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力以及病理切片評價NAP制劑對中樞膽堿能神經(jīng)元的保護作用。根據(jù)行為學研究、生化指標和病理切片結(jié)果,NAP溶液直接靜脈注射或是皮下注射對于Aβ1-40所致小鼠老年性癡呆無改善作用,即使皮下注射劑量提高5倍(10μg/kg),對記憶能力及生化指標等的改善作用仍然不夠理想。將NAP包載入NP后,能提高NAP在動物體內(nèi)的穩(wěn)定性,因此一定程度上改善小鼠的空間記憶障礙,但是NP/NAP在高劑量時(4μg/kg)仍未能使Aβ140所致小鼠老年性癡呆的記憶能力及生化指標恢復(fù)至正常水平。而將包載NAP的納米粒表面修飾TGN后,能夠顯著提高NAP腦內(nèi)遞送的效率,在劑量比NAP溶液靜脈注射及皮下注射低一倍的情況下(1μg/kg),已經(jīng)能夠產(chǎn)生明顯的空間記憶改善作用,而將劑量提至2μg/kg和4μg/kg時,能顯著降低小鼠大腦皮層與海馬區(qū)的乙酰膽堿酯酶含量,提高乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶含量,各項指標與正常對照小鼠無顯著性差異。說明TGN-NP能夠高效遞送NAP等體內(nèi)穩(wěn)定性差、難以透過血腦屏障的蛋白多肽藥物,具有良好的腦靶向性,有望顯著提高對AD治療效果。
【學位授予單位】：復(fù)旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周志友;王宏順;;表面修飾納米粒腦靶向遞藥系統(tǒng)的研究進展[J];江西中醫(yī)藥;2009年07期

2 廖應(yīng)熙,李澤輝;納米給藥系統(tǒng)的研究與比較[J];天津藥學;2003年04期

3 楊哲;納米制劑技術(shù)在靶向制劑研究中的應(yīng)用進展[J];中國醫(yī)學工程;2003年06期

4 王學清,陳真,戴俊東,張濤,夏桂民,張強;不同助懸劑對環(huán)孢素A羥丙甲纖維素酞酸酯納米粒大鼠口服后體內(nèi)相對生物利用度的影響[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2004年03期

5 陳軍,易以木;紫外分光光度法測定胰島素聚乳酸納米粒中胰島素的含量[J];廣東藥學院學報;2001年04期

6 譚軍;王小麗;劉美洲;曾昭武;張蕾;;阿奇霉素聚丁氰基丙烯酸酯納米粒的制備與高效液相色譜法檢測[J];中國醫(yī)學工程;2007年10期

7 文愛東,陳江浩,吳道澄,趙磊;多柔比星納米粒在大鼠體內(nèi)的靶向性分布研究[J];中國抗生素雜志;2001年06期

8 張良珂,侯世祥,毛聲俊,宋相容,陳彤;葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的制備工藝研究[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2004年02期

9 張耕,易以木;苦參素磷脂納米粒的研制[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2004年09期

10 張陽德,李浩,李玉坤,龔連生,黃秋,林孫穎,席浩;半乳糖化白蛋白磁性阿霉素納米粒體外殺傷肝癌細胞的實驗研究[J];中華實驗外科雜志;2004年09期

相關(guān)會議論文 前10條

1 周函;徐琳;朱光潔;董磊;張俊峰;高下;;聚乙酰亞胺納米粒轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)C57BL/6J小鼠耳蝸基底膜的實驗研究[A];2010全國耳鼻咽喉頭頸外科中青年學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

2 馬淑燕;歐陽五慶;劉玉梅;;硫酸長春堿聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的毒性研究[A];全國動物生理生化第十次學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

3 鄧聯(lián)東;藺曉娜;邢金峰;董岸杰;;聚乙二醇/聚氰基丙烯酸酯嵌段共聚物載藥納米粒的研究[A];天津市生物醫(yī)學工程學會2008年年會暨首屆生物醫(yī)學工程與臨床論壇論文集[C];2008年

4 李樹珍;歐陽五慶;;藤黃酸-聚乳酸納米粒的研制及對肝癌細胞HepG2的體外抑制作用[A];全國動物生理生化第十次學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

5 裴澄;李晶明;孫乃學;;環(huán)孢霉素A納米粒對體外兔晶狀體上皮細胞增殖的抑制作用[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術(shù)大會論文匯編[C];2007年

6 段友容;張志榮;;PELGE載藥納米粒在小鼠體內(nèi)組織分布及藥代動力學研究[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

7 侯靜文;張妍婷;郭圣榮;劉黎;;酶催化合成兩親嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚酯及其在藥劑學中的應(yīng)用[A];2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

8 段友容;朱思君;王慶瑞;劉潔;張志榮;;PELGE載藥納米粒在小鼠體內(nèi)組織分布及藥代動力學研究[A];2004年中國材料研討會論文摘要集[C];2004年

9 張慧珠;張其清;;乙酰化普魯蘭多糖的合成、表征及其載藥納米粒研究[A];天津市生物醫(yī)學工程學會2008年年會暨首屆生物醫(yī)學工程與臨床論壇論文集[C];2008年

10 黃偉;崔光華;高鐘鎬;賀俊峰;周旭;;PicoGreen熒光分光光度法測定載pDNA納米粒中pDNA的包封率[A];2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 解放軍總醫(yī)院病理科 紀小龍;納米技術(shù)在開拓新藥中應(yīng)用前景[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2001年

2 ;磁性阿霉素白蛋白納米粒在移植性肝癌模型中的磁靶向性[N];中國醫(yī)藥報;2003年

3 記者　白毅;復(fù)合物納米�？勺鳛橐葝u素口服給藥新載體[N];中國醫(yī)藥報;2006年

4 本報記者 劉云濤;DDS研發(fā) 唱響制劑時代主旋律[N];中國醫(yī)藥報;2007年

5 呂工;腦靶向給藥研究進展[N];中國醫(yī)藥報;2003年

6 甘勇 林艷瓊 陳慶華;微粒系統(tǒng)用于眼用制劑成新趨勢[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 李悅恒邋張勇;納米技術(shù)廣泛用于眼部給藥研究[N];中國醫(yī)藥報;2008年

8 本報記者 徐蘭山邋阮湘華;納米生物：創(chuàng)新在起跑線[N];科技日報;2008年

9 張中橋;四醫(yī)大西京醫(yī)院發(fā)現(xiàn)納米�？勺� VEG F基因載體[N];中國醫(yī)藥報;2007年

10 ;上海中藥研究所制備出氟苷新型給藥系統(tǒng)[N];中國醫(yī)藥報;2002年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 李婧煒;噬菌體展示技術(shù)篩選腦靶向功能肽及其修飾納米粒的腦內(nèi)遞藥研究[D];復(fù)旦大學;2012年

2 張靜;油酰殼聚糖納米粒作為抗腫瘤藥物載體的研究[D];中國海洋大學;2010年

3 蔣青鋒;腦靶向銀杏內(nèi)酯B納米粒及其兩親性載體的研究[D];南方醫(yī)科大學;2007年

4 孫望強;大分子納米粒的制備工藝及其性能研究[D];華中科技大學;2004年

5 陳名懋;選擇性膽甾化殼聚糖衍生物納米藥物載體的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

6 范輝;超分子納米粒作為抗腫瘤藥物和基因協(xié)同給藥體系的研究[D];浙江大學;2011年

7 李倩;油酰海藻酸納米�？诜\送載體的制備與性質(zhì)研究[D];中國海洋大學;2012年

8 張瑋;基于微針給藥的靶向黑素細胞抗色素沉著納米粒的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

9 黃容琴;腦靶向樹枝狀高分子納米基因遞釋系統(tǒng)的研究[D];復(fù)旦大學;2008年

10 張雪瓊;羧甲基殼聚糖智能釋藥肝靶向納米傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建與評價[D];武漢理工大學;2010年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 李斌生;載綠色熒光蛋白基因殼聚糖納米粒載體的制備和轉(zhuǎn)染的研究[D];中南大學;2004年

2 佟媛;載銀杏內(nèi)酯A納米粒的制備與理化性質(zhì)研究[D];安徽大學;2010年

3 郭妍;納米生物技術(shù)治療肝癌：p53-白蛋白納米粒的制備和轉(zhuǎn)染的研究[D];中南大學;2004年

4 王娜;治療高尿酸血癥UOX脂質(zhì)納米粒的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學;2010年

5 張慶蓮;米托蒽醌聚乳酸納米粒的制備和細胞攝取研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2011年

6 吉順莉;紫杉醇PLGA口服納米粒的制備及生物利用度的研究[D];江蘇大學;2010年

7 王同力;Tf-BCNU-PLGA納米粒制備及其對鼠C6膠質(zhì)瘤細胞作用的實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2010年

8 蔣妮;三種齊墩果酸納米粒的制備及質(zhì)量評價[D];大連醫(yī)科大學;2010年

9 喬偉立;用于兩種藥物控制釋放的納米粒/靜電紡絲復(fù)合纖維給藥系統(tǒng)的研究[D];重慶大學;2010年

10 應(yīng)曉英;納米粒載體與A549肺上皮細胞的相互作用及其體內(nèi)藥效學研究[D];浙江大學;2002年

，

本文編號：2568029