【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病，又稱老年癡呆癥。促進(jìn)AD發(fā)生發(fā)展的兩個(gè)主要致病因素是細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)的沉積和細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化。Aβ來(lái)源于β淀粉樣前體蛋白(amyloid β-protein precursor，APP)，APP通過多種蛋白質(zhì)水解途徑進(jìn)行加工，通過β-和γ-分泌酶作用途徑,產(chǎn)生Aβ片段。當(dāng)各種因素導(dǎo)致Aβ空間構(gòu)象發(fā)生錯(cuò)誤折疊轉(zhuǎn)變成以β折疊為主時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，難以被蛋白酶水解，從而在組織內(nèi)沉積并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡甚至壞死。tau蛋白是一種微管結(jié)合蛋白，具有促進(jìn)微管組裝并維持神經(jīng)元微管穩(wěn)定的作用。目前發(fā)現(xiàn)tau蛋白有6種異構(gòu)體和30多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。在AD病理?xiàng)l件下，tau蛋白的這些位點(diǎn)發(fā)生異常磷酸化，過度磷酸化的tau進(jìn)一步聚集并形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle, NFTs），使其失去與微管結(jié)合的能力，從而引起神經(jīng)細(xì)胞的丟失，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性變。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（EndoplasmicReticulum stress, ER Stress)現(xiàn)象存在于AD和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神經(jīng)退行性疾病和腦缺血等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。在AD發(fā)病過程中，各種因素導(dǎo)致Aβ空間構(gòu)象發(fā)生錯(cuò)誤折疊,轉(zhuǎn)變成以β折疊為主及磷酸化的tau增多時(shí)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，從而誘發(fā)ER應(yīng)激反應(yīng)。MANF [MesencephalicAstrocyte-derived Neurotrophic Factor，又名ARMET (Arginine rich, mutated in early stageof tumors)]，是一種在ER應(yīng)激條件下特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，在多種病理?xiàng)l件下發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血可引發(fā)局部神經(jīng)元細(xì)胞中ER應(yīng)激從而誘導(dǎo)MANF基因高表達(dá)。在體外神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，ARMET能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，，抑制ER應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，重組MANF蛋白可抑制衣霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。目前發(fā)現(xiàn)MANF對(duì)大鼠帕金森氏病模型有保護(hù)作用，而MANF在AD中的相關(guān)功能目前尚未見報(bào)道。 目的： 本課題旨在觀察MANF是否可以抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用和岡田酸誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞中tau蛋白的過度磷酸化，以了解MANF神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。 方法： 構(gòu)建MANF基因過表達(dá)質(zhì)粒pCIneo-MANF-FLAG及針對(duì)MANF基因的siRNA質(zhì)粒pLentilox3.7-MANF-siRNA。MANF基因的特異性siRNA序列為：sense：5’-GGA CCU CAA AGA CAG AGA UTT-3’，和antisense：5,-GCAGAU CGA CCU GAG CAC ATT-3’。表達(dá)和純化重組人MANF蛋白。進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)并經(jīng)NeuN染色鑒定，培養(yǎng)人來(lái)源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞和小鼠來(lái)源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a細(xì)胞，用Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性。用PI染色方法檢測(cè)死亡的細(xì)胞，用細(xì)胞免疫熒光染色觀察Aβ誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元細(xì)胞及SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)MANF、Bip/GRP78和Chop的表達(dá)。經(jīng)重組人MANF蛋白處理SH-SY5Y細(xì)胞后，或?qū)ANF過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞后，經(jīng)Aβ誘導(dǎo)，用MTT檢測(cè)法觀察SH-SY5Y和N2a細(xì)胞增殖活性變化，用TUNEL染色檢測(cè)N2a細(xì)胞轉(zhuǎn)染MANF相關(guān)質(zhì)粒后細(xì)胞凋亡情況，用免疫印跡法檢測(cè)N2a細(xì)胞轉(zhuǎn)染MANF相關(guān)質(zhì)粒后細(xì)胞蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果： 1．Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞毒性 將SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)密度，用不同濃度的Aβ處理，以空白對(duì)照組和無(wú)血清試驗(yàn)組作為對(duì)照，24hrs后用按照試劑說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行PI染色。在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡變化。與對(duì)照組相比，Aβ處理組，隨著Aβ濃度的逐漸增加，細(xì)胞死亡的數(shù)目量逐漸增多，該結(jié)果提示Aβ處理可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡。 2．Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生ER應(yīng)激 為了觀察Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是否由ER應(yīng)激介導(dǎo)，我們采用10μM的Aβ處理SH-SY5Y細(xì)胞，并用ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin, TM,2.5μg/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)檢測(cè)ER應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白CHOP/GADD153。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞中CHOP的表達(dá)。同樣，我們用10μM的Aβ處理原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元后，細(xì)胞中的BIP/GRP78、CHOP/GADD153表達(dá)增加。上述結(jié)果提示Aβ誘導(dǎo)的ER應(yīng)激可能是其細(xì)胞毒性的因素之一。 3. Aβ上調(diào)MANF表達(dá) 在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞和原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中加入濃度為10μM的Aβ，然后用MANF抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ可引起上述兩種細(xì)胞中MANF的表達(dá)明增加。 4．MANF對(duì)Aβ神經(jīng)毒性的抑制作用 4.1重組人MANF抑制Aβ的神經(jīng)毒性 用不同濃度的重組人MANF蛋白(0.5mg L~(-1),1mg L~(-1)和2mg L~(-1))處理SH-SY5Y細(xì)胞4hrs，再用Aβ25-35(10μM)處理24hrs，然后用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：重組人MANF蛋白可劑量依賴性抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，且其作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。 4.2MANF過表達(dá)減弱Aβ的神經(jīng)毒性在N2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCIneo-FLAG-MANF，轉(zhuǎn)染24hrs后給予不同濃度的Aβ處理(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)和經(jīng)10μM Aβ處理，在不同時(shí)間（4hrs、8hrs、16hrs、24hrs、48hrs）進(jìn)行MTT檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)MANF蛋白可抑制Aβ引起的神經(jīng)毒性。 4.3沉默內(nèi)源性的MANF增加Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性在N2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MANF的siRNA以沉默內(nèi)源性的MANF，在轉(zhuǎn)染24hrs后給予不同濃度的Aβ處理(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)和經(jīng)10μMAβ處理，在不同時(shí)間（4hrs、8hrs、16hrs、24hrs、48hrs）進(jìn)行MTT檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾內(nèi)源性MANF可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)A毒性的敏感性。 5．MANF對(duì)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用在N2a細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pCIneo-FLAG-MANF和pLentiLox3.7-MANF-siRNA質(zhì)粒及它們的對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24hrs后給予10μM的Aβ處理，然后進(jìn)行TUNEL染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MANF能抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而干擾內(nèi)源性MANF的表達(dá)可促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同樣免疫印跡檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MANF可以降低CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表達(dá)，沉默MANF后CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表達(dá)增加。以上結(jié)果提示，MANF可通過抑制ER應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡而抑制Aβ的神經(jīng)毒性。 6．MANF對(duì)tau蛋白過度磷酸化引起的細(xì)胞毒性抑制作用 6.1OA誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化在體外培養(yǎng)的N2a細(xì)胞加入25nmol·L~(~(-1))OA作用24hrs，然后用tau-5抗體和AT-8抗體分別對(duì)細(xì)胞內(nèi)總tau蛋白和磷酸化的tau蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA處理后磷酸化的tau蛋白水平明顯增加，而總tau蛋白水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，上述結(jié)果提示OA能誘導(dǎo)tau蛋白的過度磷酸化。 6.2.重組人MANF預(yù)處理抑制OA誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化及細(xì)胞毒作用 在N2a細(xì)胞中預(yù)先加入不同濃度（1、2、4mg·L~(-1)）重組人MANF蛋白處理4hrs后，再經(jīng)25nmol·L~(-1)OA處理24hrs以誘導(dǎo)tau過度磷酸化，收集細(xì)胞，并用免疫印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。用AT-8單克隆抗體檢測(cè)磷酸化的tau，GAPDH作為加樣對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA可誘導(dǎo)N2a細(xì)胞中tau蛋白的過度磷酸化，從而使細(xì)胞的增殖活性降低。重組人MANF蛋白（2,4mg·L~(-1)）預(yù)處理N2a細(xì)胞均能抑制OA誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化，并能顯著提高細(xì)胞的增殖活性。 6.3. MANF的表達(dá)水平對(duì)OA誘導(dǎo)的tau過度磷酸化及細(xì)胞毒的影響 在N2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1vector、pCIneo-MANF-FLAG、pLentilox3.7vector、pLentilox3.7-MANF-siRNA四種質(zhì)粒，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24hrs后經(jīng)25nmol L~(-1) OA誘導(dǎo)24hrs，收集細(xì)胞，蛋白用AT-8和GAPDH單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MANF基因過表達(dá)可明顯抑制N2a細(xì)胞中OA誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化，而siRNA下調(diào)MANF基因的表達(dá)則可促進(jìn)tau蛋白磷酸化。經(jīng)MTT檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，MANF基因過表達(dá)明顯促進(jìn)N2a細(xì)胞活性，而MANF基因沉默則可促進(jìn)OA對(duì)N2a的毒性作用。結(jié)論: Aβ可以引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，并可以誘導(dǎo)ER應(yīng)激和MANF表達(dá)；MANF可抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒作用，并可通過抑制tau的過度磷酸化而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1. Aβ 誘導(dǎo) SH-SY5Y 細(xì)胞死亡Fig1. Aβ induced cell death of SH-SY5Y cellsY cells were treated with normal medium (A1, A2), edium containing Aβ25-35 (6.25-50 μM) (A5-A12detected by Propidium iodide (PI) staining (red).s after Aβ treatment. 200×, scale bar = 50μm. (B) Tsitive cells. Values are expressed as mean ± SEM o independent experiments were analyzed. S: serum. trol group. ER 應(yīng)激和 MANF 表達(dá)SH-SY5Y 細(xì)胞 ER 應(yīng)激及 MANF 表達(dá)DD153，是 ER 應(yīng)激誘導(dǎo)的堿性亮氨酸拉鏈 。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)組（圖 2. 2）和無(wú)血清實(shí)驗(yàn)組（圖 2. 6）相比較

30圖 2.Aβ 誘導(dǎo) SH-SY5Y 細(xì)胞 ER 應(yīng)激及 MANF 表達(dá)Fig 2. Aβ induces ER stress and promotes MANF expression in human neuroblastomaSH-SY5Y cellsSH-SY5Y cells were treated with normal medium (1 4), serum-free medium(5 8),Aβ25-35 (10μM) for 24 hrs (9 12), and tunicamycin (TM, an inducer of ER stress)(2.5μg/ml) (13 16) for 24 hrs, respectively. MANF and CHOP/GADD153 were detectedwith anti-MANF (red) and anti-CHOP (green) antibody, respectively. The nuclei werestained with DAPI (blue). 400×, scale bar = 25μm.4.2.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定為了進(jìn)一步證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們用 SPF 級(jí)孕 17 天 SD 大鼠取胎鼠進(jìn)行小鼠皮層原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)到第十天用神經(jīng)元標(biāo)志物 NeuN 抗體進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞鑒定。圖 3 結(jié)果顯示，培養(yǎng)的的大部分神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)元。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫愛民;王海萍;沈玉君;沈玉先;方圣云;;Ser~(202)/Thr~(205)位點(diǎn)磷酸化tau在神經(jīng)元中的定位[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2011年01期

2 張晶晶;王法財(cái);王海萍;梁燕;沈玉先;;重組人tau蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年02期

本文編號(hào)：2546044