發(fā)布時間：2019-10-08 02:09

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種漸進性神經退行性疾病，又稱老年癡呆癥。促進AD發(fā)生發(fā)展的兩個主要致病因素是細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)的沉積和細胞內tau蛋白的過度磷酸化。Aβ來源于β淀粉樣前體蛋白(amyloid β-protein precursor，APP)，APP通過多種蛋白質水解途徑進行加工，通過β-和γ-分泌酶作用途徑,產生Aβ片段。當各種因素導致Aβ空間構象發(fā)生錯誤折疊轉變成以β折疊為主時，就會導致蛋白質聚集，難以被蛋白酶水解，從而在組織內沉積并誘導神經元凋亡甚至壞死。tau蛋白是一種微管結合蛋白，具有促進微管組裝并維持神經元微管穩(wěn)定的作用。目前發(fā)現(xiàn)tau蛋白有6種異構體和30多個絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點。在AD病理條件下，tau蛋白的這些位點發(fā)生異常磷酸化，過度磷酸化的tau進一步聚集并形成神經元纖維纏結（neurofibrillary tangle, NFTs），使其失去與微管結合的能力，從而引起神經細胞的丟失，最終導致神經退行性變。內質網應激（EndoplasmicReticulum stress, ER Stress)現(xiàn)象存在于AD和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神經退行性疾病和腦缺血等其他神經系統(tǒng)疾病中。在AD發(fā)病過程中，各種因素導致Aβ空間構象發(fā)生錯誤折疊,轉變成以β折疊為主及磷酸化的tau增多時，導致蛋白質聚集，從而誘發(fā)ER應激反應。MANF [MesencephalicAstrocyte-derived Neurotrophic Factor，又名ARMET (Arginine rich, mutated in early stageof tumors)]，是一種在ER應激條件下特異性表達的蛋白質，在多種病理條件下發(fā)揮神經保護作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血可引發(fā)局部神經元細胞中ER應激從而誘導MANF基因高表達。在體外神經元細胞培養(yǎng)實驗中，ARMET能促進神經元細胞的增殖，，抑制ER應激誘導的細胞凋亡，重組MANF蛋白可抑制衣霉素誘導的神經細胞凋亡。目前發(fā)現(xiàn)MANF對大鼠帕金森氏病模型有保護作用，而MANF在AD中的相關功能目前尚未見報道。 目的： 本課題旨在觀察MANF是否可以抑制Aβ誘導的神經細胞毒性作用和岡田酸誘導的N2a細胞中tau蛋白的過度磷酸化，以了解MANF神經保護作用的機制。 方法： 構建MANF基因過表達質粒pCIneo-MANF-FLAG及針對MANF基因的siRNA質粒pLentilox3.7-MANF-siRNA。MANF基因的特異性siRNA序列為：sense：5’-GGA CCU CAA AGA CAG AGA UTT-3’，和antisense：5,-GCAGAU CGA CCU GAG CAC ATT-3’。表達和純化重組人MANF蛋白。進行原代神經元細胞培養(yǎng)并經NeuN染色鑒定，培養(yǎng)人來源的神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y細胞和小鼠來源的神經母細胞瘤細胞株N2a細胞，用Aβ誘導神經毒性。用PI染色方法檢測死亡的細胞，用細胞免疫熒光染色觀察Aβ誘導的原代神經元細胞及SH-SY5Y細胞內MANF、Bip/GRP78和Chop的表達。經重組人MANF蛋白處理SH-SY5Y細胞后，或將MANF過表達質粒和siRNA質粒轉染N2a細胞后，經Aβ誘導，用MTT檢測法觀察SH-SY5Y和N2a細胞增殖活性變化，用TUNEL染色檢測N2a細胞轉染MANF相關質粒后細胞凋亡情況，用免疫印跡法檢測N2a細胞轉染MANF相關質粒后細胞蛋白的表達量。 結果： 1．Aβ誘導神經細胞毒性 將SH-SY5Y細胞培養(yǎng)至適當密度，用不同濃度的Aβ處理，以空白對照組和無血清試驗組作為對照，24hrs后用按照試劑說明書的操作步驟進行PI染色。在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞死亡變化。與對照組相比，Aβ處理組，隨著Aβ濃度的逐漸增加，細胞死亡的數目量逐漸增多，該結果提示Aβ處理可以誘導神經細胞死亡。 2．Aβ誘導神經細胞發(fā)生ER應激 為了觀察Aβ誘導的細胞死亡是否由ER應激介導，我們采用10μM的Aβ處理SH-SY5Y細胞，并用ER應激誘導劑衣霉素(tunicamycin, TM,2.5μg/ml)作為陽性對照，同時檢測ER應激的標志性蛋白CHOP/GADD153。結果發(fā)現(xiàn)Aβ可促進SH-SY5Y細胞中CHOP的表達。同樣，我們用10μM的Aβ處理原代培養(yǎng)的大鼠神經元后，細胞中的BIP/GRP78、CHOP/GADD153表達增加。上述結果提示Aβ誘導的ER應激可能是其細胞毒性的因素之一。 3. Aβ上調MANF表達 在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞和原代培養(yǎng)的大鼠神經元細胞中加入濃度為10μM的Aβ，然后用MANF抗體進行細胞免疫熒光檢測。結果發(fā)現(xiàn)，Aβ可引起上述兩種細胞中MANF的表達明增加。 4．MANF對Aβ神經毒性的抑制作用 4.1重組人MANF抑制Aβ的神經毒性 用不同濃度的重組人MANF蛋白(0.5mg L~(-1),1mg L~(-1)和2mg L~(-1))處理SH-SY5Y細胞4hrs，再用Aβ25-35(10μM)處理24hrs，然后用MTT方法檢測細胞增殖活性。實驗結果顯示：重組人MANF蛋白可劑量依賴性抑制Aβ25-35誘導的細胞死亡，且其作用隨時間的延長而增加。 4.2MANF過表達減弱Aβ的神經毒性在N2a細胞中轉染pCIneo-FLAG-MANF，轉染24hrs后給予不同濃度的Aβ處理(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)和經10μM Aβ處理，在不同時間（4hrs、8hrs、16hrs、24hrs、48hrs）進行MTT檢測。結果發(fā)現(xiàn)細胞內過表達MANF蛋白可抑制Aβ引起的神經毒性。 4.3沉默內源性的MANF增加Aβ誘導的神經毒性在N2a細胞中轉染MANF的siRNA以沉默內源性的MANF，在轉染24hrs后給予不同濃度的Aβ處理(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)和經10μMAβ處理，在不同時間（4hrs、8hrs、16hrs、24hrs、48hrs）進行MTT檢測。結果發(fā)現(xiàn)，干擾內源性MANF可增強細胞對A毒性的敏感性。 5．MANF對Aβ誘導的細胞凋亡的抑制作用在N2a細胞中分別轉染pCIneo-FLAG-MANF和pLentiLox3.7-MANF-siRNA質粒及它們的對照質粒，轉染24hrs后給予10μM的Aβ處理，然后進行TUNEL染色。結果發(fā)現(xiàn)，過表達MANF能抑制Aβ誘導的細胞凋亡，而干擾內源性MANF的表達可促進Aβ誘導的細胞凋亡。同樣免疫印跡檢測也發(fā)現(xiàn)過表達MANF可以降低CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表達，沉默MANF后CHOP/GADD153和激活形式的Caspase-3的表達增加。以上結果提示，MANF可通過抑制ER應激引起的細胞凋亡而抑制Aβ的神經毒性。 6．MANF對tau蛋白過度磷酸化引起的細胞毒性抑制作用 6.1OA誘導的tau蛋白過度磷酸化在體外培養(yǎng)的N2a細胞加入25nmol·L~(~(-1))OA作用24hrs，然后用tau-5抗體和AT-8抗體分別對細胞內總tau蛋白和磷酸化的tau蛋白水平進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，OA處理后磷酸化的tau蛋白水平明顯增加，而總tau蛋白水平與對照組相比無明顯差異，上述結果提示OA能誘導tau蛋白的過度磷酸化。 6.2.重組人MANF預處理抑制OA誘導的tau蛋白過度磷酸化及細胞毒作用 在N2a細胞中預先加入不同濃度（1、2、4mg·L~(-1)）重組人MANF蛋白處理4hrs后，再經25nmol·L~(-1)OA處理24hrs以誘導tau過度磷酸化，收集細胞，并用免疫印跡檢測蛋白質的表達水平。用AT-8單克隆抗體檢測磷酸化的tau，GAPDH作為加樣對照。結果發(fā)現(xiàn)，OA可誘導N2a細胞中tau蛋白的過度磷酸化，從而使細胞的增殖活性降低。重組人MANF蛋白（2,4mg·L~(-1)）預處理N2a細胞均能抑制OA誘導的tau蛋白過度磷酸化，并能顯著提高細胞的增殖活性。 6.3. MANF的表達水平對OA誘導的tau過度磷酸化及細胞毒的影響 在N2a細胞中轉染pcDNA3.1vector、pCIneo-MANF-FLAG、pLentilox3.7vector、pLentilox3.7-MANF-siRNA四種質粒，按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行轉染，轉染24hrs后經25nmol L~(-1) OA誘導24hrs，收集細胞，蛋白用AT-8和GAPDH單克隆抗體進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，MANF基因過表達可明顯抑制N2a細胞中OA誘導的tau蛋白過度磷酸化，而siRNA下調MANF基因的表達則可促進tau蛋白磷酸化。經MTT檢測分析發(fā)現(xiàn)，MANF基因過表達明顯促進N2a細胞活性，而MANF基因沉默則可促進OA對N2a的毒性作用。結論: Aβ可以引起神經細胞死亡，并可以誘導ER應激和MANF表達；MANF可抑制Aβ誘導的神經毒作用，并可通過抑制tau的過度磷酸化而對神經細胞有保護作用。
【圖文】：

圖 1. Aβ 誘導 SH-SY5Y 細胞死亡Fig1. Aβ induced cell death of SH-SY5Y cellsY cells were treated with normal medium (A1, A2), edium containing Aβ25-35 (6.25-50 μM) (A5-A12detected by Propidium iodide (PI) staining (red).s after Aβ treatment. 200×, scale bar = 50μm. (B) Tsitive cells. Values are expressed as mean ± SEM o independent experiments were analyzed. S: serum. trol group. ER 應激和 MANF 表達SH-SY5Y 細胞 ER 應激及 MANF 表達DD153，是 ER 應激誘導的堿性亮氨酸拉鏈 。免疫熒光雙標結果顯示SH-SY5Y細胞經組（圖 2. 2）和無血清實驗組（圖 2. 6）相比較

30圖 2.Aβ 誘導 SH-SY5Y 細胞 ER 應激及 MANF 表達Fig 2. Aβ induces ER stress and promotes MANF expression in human neuroblastomaSH-SY5Y cellsSH-SY5Y cells were treated with normal medium (1 4), serum-free medium(5 8),Aβ25-35 (10μM) for 24 hrs (9 12), and tunicamycin (TM, an inducer of ER stress)(2.5μg/ml) (13 16) for 24 hrs, respectively. MANF and CHOP/GADD153 were detectedwith anti-MANF (red) and anti-CHOP (green) antibody, respectively. The nuclei werestained with DAPI (blue). 400×, scale bar = 25μm.4.2.2 原代神經元培養(yǎng)及鑒定為了進一步證實上述實驗結果，我們用 SPF 級孕 17 天 SD 大鼠取胎鼠進行小鼠皮層原代神經元細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)到第十天用神經元標志物 NeuN 抗體進行原代神經元細胞鑒定。圖 3 結果顯示，培養(yǎng)的的大部分神經細胞是神經元。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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1 孫愛民;王海萍;沈玉君;沈玉先;方圣云;;Ser~(202)/Thr~(205)位點磷酸化tau在神經元中的定位[J];中國藥理學通報;2011年01期

2 張晶晶;王法財;王海萍;梁燕;沈玉先;;重組人tau蛋白對神經細胞的毒性作用[J];安徽醫(yī)科大學學報;2009年02期

本文編號：2546044