【摘要】：目的：為了避免治療阿爾茨海默病疫苗AN1792中的由佐劑所導致的腦膜腦炎等嚴重的副反應,我們用突變型的Aβ42刺激樹突狀細胞(樹突狀疫苗)制備阿爾茨海默病疫苗。在充分的評估其安全性和有效性的基礎上,進一步了解樹突狀疫苗治療阿爾茨海默病轉基因鼠的作用機制。 方法：PDAPPV7171轉基因鼠48只,小鼠經耳朵打孔編號后采用隨機數字表法分為PFDM組(接種經PFDMAβ1～42多肽致敏的樹突狀細胞疫苗,12只)、佐劑組(接種弗氏佐劑免疫的野生型Aβ1～42肽疫苗,為陽性對照組,12只)、DC組(接種未經多肽刺激的樹突狀細胞,為PFDM陰性對照組,12只)和PBS組(注射磷酸鹽緩沖液,為佐劑組陰性對照組,12只)。另選擇與PDAPPV7171且有相同遺傳背景的健康8周齡C57/B6雌性小鼠50只(用于樹突狀細胞的培養(yǎng))。腹腔注射,每組動物均間隔2周接種1次,共免疫3次。完成治療后,處死動物,獲取鼠腦,固定,石蠟包埋,然后以4um厚度連續(xù)切片；每隔六張腦切片,用免疫組化學染色的方法,觀察小鼠腦組織中Ap蛋白,核激素肝X受體(LXR),三磷酸腺苷結合盒主動轉運蛋白1(ABCA1),,膜結合蛋白酪氨酸磷酸酯酶(CD45),晚期糖基化終產物受體(RAGE),β位點APP內切酶(BACE)的表達水平。每張腦片在顯微鏡下選取5-10個區(qū)域,用體視學的方法選取海馬區(qū)的CA1,CA2,CA3,DG,Rad和皮層區(qū)進行半定量統計分析�；叶人綇�0(染色強度最密集即黑色)到255(染色強度最輕即白色)不等。所有測量采用“雙盲”的方法。 結果：(1)Aβ蛋白表達：Aβ蛋白表達PFDM組(0.18±0.035)和陽性對照組(0.29±0.078)中顯著減少,兩種疫苗之間比較沒有顯著意義的。DC組和PBS組A β蛋白幾乎沒有改變。(2)LXR蛋白表達：LXR在PFDM組及DC組分別為0.046±0.0068,0.040±0.0083,明顯高于佐劑組(0.010±0.0035)和PBS組(0.012±0.0032)。(3)ABCA1蛋白表達：ABCA1在PFDM組表達最高(9.28±1.04),DC組(4.39±0.60)明顯高于佐劑組(1.52±0.56)和PBS組(1.42±0.54)。(4)CD45蛋白表達：在PFDM組表達為0.90±0.12,明顯高于佐劑組(0.75±0.14),DC組(0.20±0.055),PBS組(0.20±0.043)。佐劑組與DC組及PBS組相比也是有顯著差異,P值均小于0.001。(5)RAGE蛋白表達：佐劑組表達最低(0.59±0.22)與其他三組相比均有顯著差異。PFDM組(1.75±0.39)也明顯低于DC組(2.02±0.47)與PBS組(4.72±0.47)。(6)BACE蛋白表達PFDM組(1.09±0.32)高于DC組(0.88±0.11)和PBS組(0.89±0.084),而佐劑組(1.08±0.29)高于PBS組(P0.05) 結論：1、該疫苗是通過多因素的作用達到一個新的免疫平衡的方式來減少Aβ的沉積。2、疫苗不發(fā)生類似AN1792實驗副作用,可能取決于LXR/ABCA1通道。3、樹突狀細胞本身也在清除Aβ的過程中扮演著阻擋副反應發(fā)生的重要角色,且沒有副作用。 目的：制備一種無毒、特異性和敏感性良好的示蹤劑,用以探測腦內沉積的Aβ,使其成為MR影像。 方法：用超小型順磁性氧化鐵顆粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)共價聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)和Aβ1-42做成MRI照影劑。選取12-18個月大的AD轉基因鼠30只及與其年齡對應的野生型的小鼠(C57B1/6J)12只,分為實驗組(注射USPIO-PEG-Aβ1-42轉基因鼠,12只),USPUO注射組(注射USPIO轉基因鼠,9只),USPIO-Aβ1-42注射組(注射USPIO-Aβ1-42轉基因鼠,9只)及與野生型小鼠組(注射USPIO-PEG-Aβ1-42,12只)。所有示蹤劑注射劑量為0.2mMol Fe/Kg小鼠體重,通過左側股靜脈用PHD2000注射泵以60ul/min的速度注射小鼠體內,四小時后,在7-T的Micro-MRI下進行活體(in-vivo),持續(xù)2小時20min。完成活體掃描后,處死動物,獲取鼠腦,PLP固定過夜,轉移到DMSO中保存,直到離體(ex-vivo)大腦掃描；MRI每個層面距離是100umm,有利于接下來對MRI圖像的處理。在MRI上探測到的Aβ在T2加權像上與病理切片進行比對。隨后,用兩種不同的方法對MRI圖像進行分析。對活體的MRI連續(xù)圖像進行T2*的測量,對離體的MRI圖像行兩兩比較的統計參數圖(statistical parametric mapping, SPM)的體素分析(voxel-based analysis, VBA).最后對腦組織行紅顏色標記的Aβ染色和鐵染色。 另外選取兩只轉基因鼠通過頸內動脈注射相同劑量的USPIO-PEG-Aβ1-42用來評價注射方式的改變是否影響示蹤劑在腦內的沉積。 結果：注射了USPIO-PEG-Aβ1-42的轉基因鼠與注射了USPIO, USPIO-Aβ1-42的轉基因鼠行VBA分析,結果顯示在平層區(qū)和海馬區(qū)有著顯著差別；在注射了USPIO-PEG-Aβ1-42的轉基因鼠與在注射了同樣劑量的USPIO-PEG-Aβ1-42的野生型的小鼠相比,也得到了相類似的結果；通過T2*的分析,結果顯示出與VBA結果相一致；在雙重染色的病理圖片上我們能清楚地看到USPIO-PEG-Aβ1-42和腦內的Aβ很好的結合；經USPIO-PEG-Aβ1-42處理的試驗組,無論是在活體的或離體鼠腦老年斑在MRI成像質量均很高。 結論：示蹤劑USPIO-PEG-Aβ1-42可以透過血腦屏障結合轉基因鼠腦內Aβ,并能在MRI上清楚地成像。股靜脈注射是一種微侵襲的注射方法,便于以后對AD腦內Aβ的探測以進行縱向比較。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

【共引文獻】

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1 李家林;王金環(huán);;阿爾茨海默病免疫治療的研究進展[J];新醫(yī)學;2012年01期

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1 高寶兵;常壓高氧對APP/PS1雙重轉基因小鼠的保護作用[D];重慶醫(yī)科大學;2010年

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本文編號：2545822