【摘要】：目的：為了避免治療阿爾茨海默病疫苗AN1792中的由佐劑所導(dǎo)致的腦膜腦炎等嚴(yán)重的副反應(yīng),我們用突變型的Aβ42刺激樹突狀細(xì)胞(樹突狀疫苗)制備阿爾茨海默病疫苗。在充分的評估其安全性和有效性的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步了解樹突狀疫苗治療阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因鼠的作用機(jī)制。 方法：PDAPPV7171轉(zhuǎn)基因鼠48只,小鼠經(jīng)耳朵打孔編號后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為PFDM組(接種經(jīng)PFDMAβ1～42多肽致敏的樹突狀細(xì)胞疫苗,12只)、佐劑組(接種弗氏佐劑免疫的野生型Aβ1～42肽疫苗,為陽性對照組,12只)、DC組(接種未經(jīng)多肽刺激的樹突狀細(xì)胞,為PFDM陰性對照組,12只)和PBS組(注射磷酸鹽緩沖液,為佐劑組陰性對照組,12只)。另選擇與PDAPPV7171且有相同遺傳背景的健康8周齡C57/B6雌性小鼠50只(用于樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng))。腹腔注射,每組動(dòng)物均間隔2周接種1次,共免疫3次。完成治療后,處死動(dòng)物,獲取鼠腦,固定,石蠟包埋,然后以4um厚度連續(xù)切片；每隔六張腦切片,用免疫組化學(xué)染色的方法,觀察小鼠腦組織中Ap蛋白,核激素肝X受體(LXR),三磷酸腺苷結(jié)合盒主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(ABCA1),,膜結(jié)合蛋白酪氨酸磷酸酯酶(CD45),晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE),β位點(diǎn)APP內(nèi)切酶(BACE)的表達(dá)水平。每張腦片在顯微鏡下選取5-10個(gè)區(qū)域,用體視學(xué)的方法選取海馬區(qū)的CA1,CA2,CA3,DG,Rad和皮層區(qū)進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析�；叶人綇�0(染色強(qiáng)度最密集即黑色)到255(染色強(qiáng)度最輕即白色)不等。所有測量采用“雙盲”的方法。 結(jié)果：(1)Aβ蛋白表達(dá)：Aβ蛋白表達(dá)PFDM組(0.18±0.035)和陽性對照組(0.29±0.078)中顯著減少,兩種疫苗之間比較沒有顯著意義的。DC組和PBS組A β蛋白幾乎沒有改變。(2)LXR蛋白表達(dá)：LXR在PFDM組及DC組分別為0.046±0.0068,0.040±0.0083,明顯高于佐劑組(0.010±0.0035)和PBS組(0.012±0.0032)。(3)ABCA1蛋白表達(dá)：ABCA1在PFDM組表達(dá)最高(9.28±1.04),DC組(4.39±0.60)明顯高于佐劑組(1.52±0.56)和PBS組(1.42±0.54)。(4)CD45蛋白表達(dá)：在PFDM組表達(dá)為0.90±0.12,明顯高于佐劑組(0.75±0.14),DC組(0.20±0.055),PBS組(0.20±0.043)。佐劑組與DC組及PBS組相比也是有顯著差異,P值均小于0.001。(5)RAGE蛋白表達(dá)：佐劑組表達(dá)最低(0.59±0.22)與其他三組相比均有顯著差異。PFDM組(1.75±0.39)也明顯低于DC組(2.02±0.47)與PBS組(4.72±0.47)。(6)BACE蛋白表達(dá)PFDM組(1.09±0.32)高于DC組(0.88±0.11)和PBS組(0.89±0.084),而佐劑組(1.08±0.29)高于PBS組(P0.05) 結(jié)論：1、該疫苗是通過多因素的作用達(dá)到一個(gè)新的免疫平衡的方式來減少Aβ的沉積。2、疫苗不發(fā)生類似AN1792實(shí)驗(yàn)副作用,可能取決于LXR/ABCA1通道。3、樹突狀細(xì)胞本身也在清除Aβ的過程中扮演著阻擋副反應(yīng)發(fā)生的重要角色,且沒有副作用。 目的：制備一種無毒、特異性和敏感性良好的示蹤劑,用以探測腦內(nèi)沉積的Aβ,使其成為MR影像。 方法：用超小型順磁性氧化鐵顆粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)共價(jià)聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)和Aβ1-42做成MRI照影劑。選取12-18個(gè)月大的AD轉(zhuǎn)基因鼠30只及與其年齡對應(yīng)的野生型的小鼠(C57B1/6J)12只,分為實(shí)驗(yàn)組(注射USPIO-PEG-Aβ1-42轉(zhuǎn)基因鼠,12只),USPUO注射組(注射USPIO轉(zhuǎn)基因鼠,9只),USPIO-Aβ1-42注射組(注射USPIO-Aβ1-42轉(zhuǎn)基因鼠,9只)及與野生型小鼠組(注射USPIO-PEG-Aβ1-42,12只)。所有示蹤劑注射劑量為0.2mMol Fe/Kg小鼠體重,通過左側(cè)股靜脈用PHD2000注射泵以60ul/min的速度注射小鼠體內(nèi),四小時(shí)后,在7-T的Micro-MRI下進(jìn)行活體(in-vivo),持續(xù)2小時(shí)20min。完成活體掃描后,處死動(dòng)物,獲取鼠腦,PLP固定過夜,轉(zhuǎn)移到DMSO中保存,直到離體(ex-vivo)大腦掃描；MRI每個(gè)層面距離是100umm,有利于接下來對MRI圖像的處理。在MRI上探測到的Aβ在T2加權(quán)像上與病理切片進(jìn)行比對。隨后,用兩種不同的方法對MRI圖像進(jìn)行分析。對活體的MRI連續(xù)圖像進(jìn)行T2*的測量,對離體的MRI圖像行兩兩比較的統(tǒng)計(jì)參數(shù)圖(statistical parametric mapping, SPM)的體素分析(voxel-based analysis, VBA).最后對腦組織行紅顏色標(biāo)記的Aβ染色和鐵染色。 另外選取兩只轉(zhuǎn)基因鼠通過頸內(nèi)動(dòng)脈注射相同劑量的USPIO-PEG-Aβ1-42用來評價(jià)注射方式的改變是否影響示蹤劑在腦內(nèi)的沉積。 結(jié)果：注射了USPIO-PEG-Aβ1-42的轉(zhuǎn)基因鼠與注射了USPIO, USPIO-Aβ1-42的轉(zhuǎn)基因鼠行VBA分析,結(jié)果顯示在平層區(qū)和海馬區(qū)有著顯著差別；在注射了USPIO-PEG-Aβ1-42的轉(zhuǎn)基因鼠與在注射了同樣劑量的USPIO-PEG-Aβ1-42的野生型的小鼠相比,也得到了相類似的結(jié)果；通過T2*的分析,結(jié)果顯示出與VBA結(jié)果相一致；在雙重染色的病理圖片上我們能清楚地看到USPIO-PEG-Aβ1-42和腦內(nèi)的Aβ很好的結(jié)合；經(jīng)USPIO-PEG-Aβ1-42處理的試驗(yàn)組,無論是在活體的或離體鼠腦老年斑在MRI成像質(zhì)量均很高。 結(jié)論：示蹤劑USPIO-PEG-Aβ1-42可以透過血腦屏障結(jié)合轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ,并能在MRI上清楚地成像。股靜脈注射是一種微侵襲的注射方法,便于以后對AD腦內(nèi)Aβ的探測以進(jìn)行縱向比較。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李家林;王金環(huán);;阿爾茨海默病免疫治療的研究進(jìn)展[J];新醫(yī)學(xué);2012年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 高寶兵;常壓高氧對APP/PS1雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的保護(hù)作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

，

本文編號：2545822