發(fā)布時(shí)間：2019-08-19 12:18

【摘要】：研究背景： 甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH)屬于苯丙胺類神經(jīng)興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant, ATS),其鹽酸鹽為透明的結(jié)晶體,外觀狀如冰,俗稱“冰毒”,屬于一種新型毒品,也是目前危害最為嚴(yán)重和廣泛的毒品之一。冰毒具有中樞神經(jīng)興奮性、致幻、食欲抑制和擬交感能效應(yīng)等藥理學(xué)、毒理學(xué)特性。過去曾作為抗疲勞劑、減肥藥廣泛使用,但隨后發(fā)現(xiàn)其具有嚴(yán)重的精神依賴性,已被列為聯(lián)合國(guó)精神藥品公約管制的精神活性藥物。由于METH具有見效快、興奮作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),價(jià)格低廉,化學(xué)合成技術(shù)簡(jiǎn)單,多途徑攝取等特點(diǎn),導(dǎo)致快速地濫用及蔓延。冰毒號(hào)稱“毒品之王”,其最大的特點(diǎn)是致癮性強(qiáng),戒斷困難。近年國(guó)際和國(guó)內(nèi)大中城市的濫用情況十分嚴(yán)峻,吸毒不僅造成吸毒者機(jī)體和精神損害,而且造成艾滋病等多種疾病傳播,嚴(yán)重影響人體身心健康。毒品相關(guān)的刑事犯罪和社會(huì)治安等問題,對(duì)社會(huì)的穩(wěn)定造成極大危害。因此,METH的神經(jīng)毒性損傷、成癮機(jī)制的研究,是全世界面臨的重大課題和研究熱點(diǎn)。 METH具有多種藥理、毒理學(xué)特性,尤其是具有很強(qiáng)的中樞興奮作用和強(qiáng)烈的藥物依賴性,長(zhǎng)期濫用可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)和行為學(xué)的改變。對(duì)METH成癮者而言,毒品影響的不僅是精神,還包括神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的損傷性改變。近年來的研究顯示,METH有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性,可導(dǎo)致大腦出現(xiàn)與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)和帕金森病(Parkinson's disease, PD)等退行性神經(jīng)病變類似的病理學(xué)改變。現(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示,其可能的機(jī)制主要包括：氧化應(yīng)激損傷作用、體溫平衡失調(diào)、離子穩(wěn)態(tài)破壞以及細(xì)胞凋亡相關(guān)通路的激活等。但是,現(xiàn)有的研究結(jié)果仍不足以充分闡釋METH的神經(jīng)毒性機(jī)制,對(duì)其毒性作用尚缺乏有效的防治手段。 在我們前一階段的研究中,對(duì)METH處理大鼠的額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬等部位的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析,發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、蛋白酶體功能失調(diào)以及凋亡等可能是參與METH神經(jīng)毒性的主要機(jī)制。其中,一種新型的一氧化氮(nitric oxide, NO)生成調(diào)節(jié)酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(Nω, Nω-dimethyl-L-arginine dimethylaminohydrolase, DDAH1)在紋狀體和額葉皮質(zhì)的高表達(dá)尤其令人矚目。DDAH是近年發(fā)現(xiàn)的一種蛋白酶,在體內(nèi)存在生物學(xué)活性相似的兩種亞型DDAH1和DDAH2,其中DDAH1主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。DDAH主要參與不對(duì)稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylated L-arginine, ADMA)的分解代謝,體內(nèi)95%以上的ADMA均由DDAH分解代謝,調(diào)控正常生理情況下不同的組織器官內(nèi)的ADMA濃度維持在相應(yīng)的水平。研究發(fā)現(xiàn),UDMA是含有甲基化精氨酸蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物,是內(nèi)源性的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的抑制劑,對(duì)三種亞型的NOS均有抑制作用。蛋白質(zhì)甲基化是生物體內(nèi)普遍存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾現(xiàn)象,蛋白質(zhì)的甲基化和甲基化蛋白質(zhì)的降解,是機(jī)體內(nèi)存在的正常生理過程。某些病理情況下,體內(nèi)ADMA濃度下降可導(dǎo)致其對(duì)NOS的抑制作用減弱,引起組織內(nèi)NO合成增加�？梢�,DDAH可以通過調(diào)節(jié)組織內(nèi)ADMA的降解率,從而調(diào)節(jié)組織中NOS的活性和NO的合成。正常生理?xiàng)l下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NO主要通過神經(jīng)型NOS (nitric oxide synthase, nNOS)產(chǎn)生,作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮生理作用并可調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的可塑性。而在氧化應(yīng)激等病理?xiàng)l件下,產(chǎn)生的過量NO,則有可能對(duì)組織造成損害。研究證明,氧化應(yīng)激可在損傷過程中產(chǎn)生大量的NO,NO和超氧陰離子的產(chǎn)物可造成腦組織DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷、功能喪失和死亡,在衰老和AD等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。 我們前一階段的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示METH可引起大鼠腦組織多部位神經(jīng)毒性損傷,多巴胺及代謝產(chǎn)物的耗竭,紋狀體NOS活性升高,NO含量提高,小膠質(zhì)細(xì)胞激活等。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,對(duì)METH注射后大鼠紋狀體、皮質(zhì)、海馬等部位部位的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析,尋找和鑒定出30個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn),3個(gè)NO相關(guān)蛋白即硝化蛋白。同時(shí),我們采用PC12細(xì)胞的體外急性METH中毒模型的研究表明,氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、蛋白酶體功能失調(diào)、凋亡及重要結(jié)構(gòu)蛋白的硝化等可能是METH神經(jīng)毒性的主要機(jī)制。 蛋白質(zhì)硝基化作用是一種特殊的蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用,屬于氧化應(yīng)激反應(yīng)的通路之一。在大量NO介導(dǎo)下,組織內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氮類物質(zhì)(reactive nitrogen species, RNS)可對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)的3位酪氨酸產(chǎn)生硝基化作用,生成3-硝基酪氨酸(3-NT),從而導(dǎo)致蛋白功能的失活。研究表明,許多典型的神經(jīng)退行性疾病中可發(fā)生大量的蛋白質(zhì)硝基化水平升高現(xiàn)象。因此我們首次提出,DDAH1/ADMA/NOS通路介導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化作用可能是METH神經(jīng)毒性機(jī)制的重要組成部分。 為了更深入的研究蛋白質(zhì)硝基化作用與METH的神經(jīng)毒性機(jī)制之間的關(guān)系,本次研究采用多巴胺能神經(jīng)元體外模型PC12細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。PC12細(xì)胞在神經(jīng)生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)后,形態(tài)學(xué)及功能方面向交感神經(jīng)元分化。由于PC12細(xì)胞的神經(jīng)元分化特性,目前已做為一個(gè)廣泛使用的神經(jīng)元體外模型,用于神經(jīng)生物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)毒素等方面的研究,也是一個(gè)可行的METH神經(jīng)蛋白組學(xué)研究模型。因此,我們運(yùn)用PC12細(xì)胞系進(jìn)行METH體外損傷實(shí)驗(yàn),探討METH對(duì)PC12細(xì)胞的毒性損傷作用,并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及質(zhì)譜分析技術(shù),對(duì)METH作用PC12后的硝基化蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析,進(jìn)一步探討DDAH1/ADMA/NOS通路介導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化作用對(duì)靶蛋白的功能影響。同時(shí),我們采用DDAH1的經(jīng)典抑制劑L-257對(duì)該通路進(jìn)行有效抑制,通過與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較,分析DDAH1/ADMA/NOS通路與蛋白質(zhì)硝基化作用間的因果關(guān)系,并對(duì)硝基化蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。 目的： 建立單純METH急性中毒和經(jīng)L-257預(yù)處理的METH急性中毒PC12細(xì)胞模型,運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC)等方法,了解METH的神經(jīng)毒性作用及L-257預(yù)處理對(duì)METH神經(jīng)毒性的保護(hù)作用,檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)與METH毒性作用密切相關(guān)的硝基化因素NOS、NO含量的表達(dá)變化,對(duì)硝基化水平升高的蛋白進(jìn)行定性、定量分析,探討DDAH1/ADMA/NOS通路介導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化作用與METH神經(jīng)毒性之間的關(guān)系。 方法： 1.METH對(duì)PC12細(xì)胞毒性損傷及L-257的保護(hù)作用 采用已分化的PC12細(xì)胞,用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1：100雙抗)進(jìn)行培養(yǎng),將細(xì)胞置于37℃,5%C02的培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(陰性對(duì)照)和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組根據(jù)L-257濃度的不同而分為4組,L-257含量分別為0μmol/L(陽(yáng)性對(duì)照)、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L,各組METH含量均為2.0mmol/L。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,達(dá)80%匯合后各實(shí)驗(yàn)組分別用上述不同濃度METH和L-257處理,對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h。倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)改變,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,nnexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,NO檢測(cè)試劑盒硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞上清液NO含量,NOS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NO上游NOS活力,Western blot技術(shù)檢測(cè)NO下游產(chǎn)物總3-硝基酪氨酸表達(dá)水平。 2.應(yīng)用SILAC技術(shù)對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)METH誘導(dǎo)的硝基化蛋白的鑒定 采用同位素對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,以使各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)總蛋白分子量分別增多4-6和8-10,通過不同分子量對(duì)各組間的蛋白質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。已分化的PC12細(xì)胞分為3組：(1)輕鏈組(對(duì)照組,L),采用輕鏈培養(yǎng)液(高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)；(2)中鏈組(METH+L-257, M),采用中鏈培養(yǎng)液(缺乏L-精氨酸-L賴氨酸的高糖DMEM培養(yǎng)基+10%的富含2H4-L-賴氨酸和13C6-L-精氨酸的胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng),分子量偏移增加4至6；(3)重鏈組(METH, H),采用重鏈培養(yǎng)液(缺乏L-賴氨酸-L-賴氨酸的高糖DMEM培養(yǎng)基+10%的富含13C6-’N2-L-賴氨酸和13C6-15N4-L-精氨酸的胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng),分子量偏移增加8至10。 將3組PC12細(xì)胞接種于6孔板中,給予對(duì)應(yīng)的同位素培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),穩(wěn)定傳代6代以上,再次接種于10cm2培養(yǎng)皿中,每組2個(gè)培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,達(dá)80%匯合時(shí)棄去上層培養(yǎng)液,并進(jìn)行以下處理：輕鏈組加入高糖DMEM培養(yǎng)基；中鏈組加入含2.0mmol/L METH和50μmol/L抑制劑L-257的中鏈DMEM;重鏈組加入含2.0mmol/L METH的重鏈DMEM。以上三組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),分別提取各組總蛋白。然后將3組蛋白混合,采用免疫共沉淀法提取總硝基化蛋白。SDS電泳分離總硝基化蛋白,對(duì)各個(gè)條帶進(jìn)行切膠、酶切和肽段抽提。采用LC-MS/MS質(zhì)譜對(duì)肽段進(jìn)行掃描,對(duì)各組內(nèi)的硝基化蛋白進(jìn)行定性、定量分析。 3. METH作用下L-257對(duì)GSTP1蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(陰性對(duì)照)和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組根據(jù)L-257濃度的不同而分為4組,L-257含量分別為Oμmol/L (陽(yáng)性對(duì)照)、10μml/L、50μmol/L、100μmo/L各實(shí)驗(yàn)組均采用2.0mmol/LMETH處理。采用Western-blot技術(shù)對(duì)各組GSTP1蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。 結(jié)果： 1.1METH對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響及L-257的保護(hù)作用 METH+L-257處理組PC12細(xì)胞胞體逐漸萎縮變圓,變圓細(xì)胞的胞質(zhì)透亮度增加,胞漿內(nèi)可見環(huán)形透亮區(qū),細(xì)胞突起變短、斷裂、消失,細(xì)胞間神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸消失,因細(xì)胞突起萎縮可在細(xì)胞表面形成毛刺狀,細(xì)胞邊界不清晰,并可見細(xì)胞脫壁漂浮現(xiàn)象。隨著L-257濃度降低,細(xì)胞形態(tài)損傷呈增強(qiáng)趨勢(shì),100μmol/L及50μmol/L處理組主要以胞體變圓及胞漿透亮增加為主,而降低至25μmol/L時(shí)突起的改變開始變明顯,并有毛刺狀結(jié)構(gòu)形成,此現(xiàn)象在10μmol/L及Oμmol/L組尤為明顯,細(xì)胞突起及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)基本消失。 1.2METH作用下L-257對(duì)PC12細(xì)胞存活率的保護(hù)作用 結(jié)果顯示,隨著L-257濃度逐漸增加,MTT法測(cè)得經(jīng)METH(2.0mmol/L)處理的PC12細(xì)胞OD值逐漸升高,細(xì)胞存活率逐漸升高,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.001,F=816.687)。 1.3METH作用下L-257對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 結(jié)果顯示,隨著L-257濃度的不斷升高,經(jīng)METH (2.0mmol/L)處理的PC12細(xì)胞凋亡率逐漸下降,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.001,F=119.436)。 1.4METH作用下L-257對(duì)PC12細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度的影響 結(jié)果顯示,隨著L-257濃度逐漸增加,經(jīng)METH (2.0mmol/L)處理的PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量逐漸減少。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,除100劑量組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P=0.170),其余各組均有顯著性差異(P0.001,F=50.030)。 1.5METH作用下L-257對(duì)PC12細(xì)胞NOS活性的影響 結(jié)果顯示隨著L-257濃度逐漸增加,經(jīng)METH(2.0mmol/L)處理的PC12細(xì)胞總NOS活力逐漸減少。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,除100劑量組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P=0.246),其余實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P0.008,F=29.043)。 1.6METH作用下L-257對(duì)PC12細(xì)胞總硝基化蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組相比總硝基化蛋白表達(dá)在15-170KD范圍內(nèi)普遍升高。L-257對(duì)硝基化作用可產(chǎn)生明顯的抑制效果：隨著L-257濃度的升高,硝基化蛋白的總體表達(dá)水平逐漸降低。 2.1SILAC方法對(duì)硝基化蛋白的鑒定和比較 SILAC方法共鑒定出蛋白42個(gè),其中硝基化水平升高的共27個(gè)：升高0-10%的為6個(gè),升高10%-20%的為12個(gè),升高20%-30%的為6個(gè),30%以上的為1個(gè),L-257對(duì)蛋白質(zhì)的硝基化作用具有不同程度的抑制效果。其中共有15種核糖體蛋白硝基化水平不同程度地升高,71kDa熱休克同源蛋白、輔肌動(dòng)蛋白α1和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1的硝基化水平明顯升高。 2.2METH作用下GSTP1蛋白表達(dá)變化 結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組(單純METH)相比,GSPT1蛋白表達(dá)顯著降低。L-257對(duì)GSPT1蛋白的下降趨勢(shì)可起到明顯的抑制作用：隨著L-257濃度的升高,GSTP1蛋白的表達(dá)逐漸上升。 結(jié)論： 1. METH對(duì)PC12細(xì)胞具有神經(jīng)毒性作用,能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,L-257對(duì)METH的神經(jīng)毒性具有明顯的保護(hù)作用。 2. METH可通過DDAH1/ADMA/NOS通路使PC12細(xì)胞NOS活力和NO含量增加,通過氧化應(yīng)激引起靶蛋白硝基化水平升高,造成PC12細(xì)胞活力下降,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 3.L-257可通過抑制DDAH1/ADMA/NOS通路而有效抑制靶蛋白的硝基化作用,從而降低PC12細(xì)胞的凋亡率和死亡率,發(fā)揮顯著的神經(jīng)毒性保護(hù)作用。 4. METH誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化作用參與了氧化應(yīng)激、凋亡和細(xì)胞骨架損傷等神經(jīng)損傷過程,可能是METH神經(jīng)毒性的重要機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R749.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2528248