【摘要】：阿爾茨海默�。ˋlzheimer’s disease，AD）是以慢性進行性認(rèn)知功能障礙為特征的常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前尚無有效預(yù)防及治療手段。AD是引起癡呆的主要疾病。據(jù)研究估算，2010年全球約有3560萬癡呆患者，此數(shù)量大約以每20年翻倍的速度增長，預(yù)計到2030年將有6570萬癡呆患者，到2050年將有1.154億人患有癡呆~([1])。AD的主要病理學(xué)特征為細胞外老年斑、細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元和突觸缺失。淀粉樣肽（amyloid β peptide，Aβ）是構(gòu)成老年斑的主要成分。大量研究表明，A β是AD發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素，因此阻斷Aβ有可能成為有效的治療靶點。 近來的研究表明，線粒體功能障礙與年齡相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有關(guān)。線粒體功能障礙出現(xiàn)于AD早期，表現(xiàn)為能量代謝障礙，自由基產(chǎn)生增多，細胞內(nèi)鈣超載等。Aβ引起的線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能損傷在AD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。在過度表達突變APP的轉(zhuǎn)基因小鼠和AD患者的腦內(nèi)，A在線粒體中進行性聚集，對線粒體產(chǎn)生毒性作用。引起研究人員關(guān)注的是：線粒體內(nèi)Aβ與Aβ相關(guān)乙醇脫氫酶（amyloid β binding alcoholdehydrogenase，，ABAD）的相互作用引起有害的中間代謝物的聚集，加重了線粒體損傷。A β相關(guān)乙醇脫氫酶阻斷肽（ABAD decoy peptide，ABAD-DP）即ABAD的L_D拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)的92-120氨基酸區(qū)，含有能與Aβ結(jié)合的區(qū)域，外源性給予ABAD-DP可在線粒體內(nèi)競爭性拮抗ABAD與Aβ的結(jié)合，保護線粒體的ABAD活性，可抑制或拮抗A β的細胞毒性作用。因此，ABAD-DP為治療AD帶來了希望，而如何合成能在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達的，并可與Aβ高效結(jié)合的ABAD-DP成為在AD防治中亟待解決的問題。 本研究以肽適配子為基礎(chǔ)，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將ABAD-DP插入到人硫氧化還原蛋白（thioredoxin，TRX）的活性位點中間，構(gòu)建TRX1-ABAD-DP-TRX2（T-A-T）融合基因，通過腺相關(guān)病毒實現(xiàn)適配子T-A-T的穩(wěn)定表達；并通過體外實驗，進一步驗證適配子T-A-T對A細胞內(nèi)毒性的拮抗作用，以期開發(fā)AD治療的新途徑。研究共分2個部分： 第一部分構(gòu)建穩(wěn)定表達A相關(guān)乙醇脫氫酶阻斷肽適配子（TRX1-ABAD-DP-TRX2）的重組腺相關(guān)病毒 目的：利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達TRX1-ABAD-DP-TRX2（T-A-T）的重組腺相關(guān)病毒。方法：①通過PCR獲得目的片段TRX1、ABAD-DP及TRX2，采用Sanger末端終止法測出全部的核苷酸序列，并進行酶切鑒定。進一步將上述3個目的片段按既定順序插入腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒pSSHG-CMV的多克隆位點，從而獲得融合基因T-A-T，進行酶切鑒定。②經(jīng)聚乙酰亞胺介導(dǎo)三質(zhì)粒（pSSHG/T-A-T、pAAV/Ad及pHelper）轉(zhuǎn)染HeLa細胞，回收得到重組腺相關(guān)病毒rAAV/T-A-T，用實時定量PCR法測定病毒滴度。③rAAV/T-A-T感染NIH-3T3細胞，行免疫熒光組織化學(xué)染色檢測適配子T-A-T的表達。結(jié)果：①TRX1、ABAD-DP、TRX2的核苷酸序列與實驗設(shè)計完全相符，基因片段長度分別為114bp、93bp、235bp，酶切鑒定結(jié)果也與理論值一致。T-A-T融合基因片段的大小約為435bp，與理論值相符。②重組腺相關(guān)病毒rAAV/T-A-T的滴度為3.45×10~8/ml。③rAAV/T-A-T感染NIH-3T3細胞后，免疫熒光組織化學(xué)染色顯示90％以上的細胞呈現(xiàn)綠色熒光。結(jié)論：①成功構(gòu)建了A相關(guān)乙醇脫氫酶阻斷肽適配子T-A-T。②成功構(gòu)建了表達T-A-T的重組腺相關(guān)病毒rAAV/T-A-T。 第二部分重組腺相關(guān)病毒rAAV/T-A-T對細胞內(nèi)Aβ_(42)拮抗作用的研究 目的：利用AD細胞模型，驗證表達適配子T-A-T的腺相關(guān)病毒（rAAV/T-A-T）對細胞內(nèi)Aβ_(42)的拮抗作用。方法：①包裝重組逆轉(zhuǎn)錄病毒rL42SN，建立細胞內(nèi)表達Aβ_(42)的AD細胞模型，行免疫熒光組織化學(xué)染色檢測Aβ_(42)的表達。②rAAV/T-A-T和rL42SN感染NIH-3T3細胞，行免疫熒光組織化學(xué)染色檢測適配子T-A-T及Aβ_(42)在細胞內(nèi)的定位。③用SH-SY5Y細胞進一步驗證適配子T-A-T對細胞內(nèi)Aβ_(42)的拮抗作用。分為4組：正常對照組、T-A-T組、A組及T-A-T+A組，加入相應(yīng)病毒感染72h，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)改變，進行MTT染色。結(jié)果：①rL42SN感染NIH-3T3細胞后，免疫熒光組織化學(xué)染色顯示90%以上的細胞呈現(xiàn)紅色熒光。②用免疫熒光組織化學(xué)染色方法檢測到綠色熒光及紅色熒光共同定位于NIH-3T3細胞質(zhì)內(nèi)。③顯微鏡下見SH-SY5Y細胞在正常對照組與T-A-T組狀態(tài)良好，密度較高；A組細胞密度較低，狀態(tài)不佳，可見大量細胞出現(xiàn)凋亡及壞死；T-A-T+A組，細胞狀態(tài)明顯好于A組。④MTT結(jié)果顯示，與正常對照組相比，A組的細胞活力顯著降低（p0.05），T-A-T組與正常對照組的細胞活力差異無顯著性意義（p0.05），T-A-T+A組的細胞活力較A組明顯增高（p0.05）。結(jié)論：①成功建立了細胞內(nèi)高表達Aβ_(42)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒rL42SN。②適配子T-A-T能夠與A42在細胞內(nèi)結(jié)合。③適配子T-A-T可拮抗Aβ_(42)的細胞內(nèi)毒性作用。
【圖文】：

振的研究發(fā)現(xiàn)，ABAD與A 結(jié)合的位點位于LD拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)上，ABAD-A 復(fù)合物的形成阻止了ABAD與NAD+的結(jié)合，引起ABAD空間構(gòu)像改變及活性喪失（圖1.1） ，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，進而增強了A 的毒性作用，即增加了活性氧的產(chǎn)生，提高了caspase-3活性，引起線粒體能量代謝異常，加重了AD轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶力障礙及神經(jīng)病理學(xué)改變 。ABAD活性的降低也影響雌激素的代謝，從而破壞雌激素的神經(jīng)保護作用加重A 的毒性 。因此阻斷ABAD與A 的相互作用可能成為潛在的AD治療策略 。

特異性結(jié)合小分子代謝物，通過構(gòu)象變化，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上調(diào)節(jié)表達。核糖開關(guān)廣泛存在于細菌的代謝相關(guān)基因中，在真菌、植物中發(fā)現(xiàn)。此外，研究者從龐大的隨機文庫中篩選出與靶標(biāo)高度結(jié)合的適。SELEX 是體外篩選適配子的重要手段，適配子的篩選方法隨后被簡自動的體外過程，為高通量的篩選開辟了道路 。SELEX 可以有效一個含有 1014-15個隨機序列的復(fù)合核酸或核苷酸文庫中篩選出一個或與靶標(biāo)緊密結(jié)合的序列。通常，這些適配子-靶標(biāo)復(fù)合體的解離常數(shù)（Kd高皮摩爾到低納摩爾。篩選過程可概括為三個步驟：（1）選擇與靶標(biāo)的配基；（2）分離適配子與非適配子；（3）擴增適配子 （圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊宇,王全師,吳江,胡海濤,胡林森,楊廣笑;通用腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及表達報告基因GFP的研究[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2004年01期

2 王旭;楊宇;吳江;;適配子技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進展[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2011年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 楊欣;穩(wěn)定融合表達拮抗Aβ_（1-42）肽細胞內(nèi)毒性的適配子策略及其作用機制的研究[D];吉林大學(xué);2008年

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 孫欣;細胞內(nèi)非分泌表達淀粉樣蛋白Aβ_（1-42）所致細胞毒作用的研究[D];吉林大學(xué);2006年

本文編號：2520508