【摘要】：目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種引起老年人癡呆的最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,目前尚無(wú)有效的治療方法。β淀粉樣肽(P-amyloid peptide,Aβ)寡聚體是AD發(fā)生的早期始動(dòng)因子。本研究擬在Ap寡聚體特異性單抗A8基礎(chǔ)上,構(gòu)建單鏈抗體(single chain fragmen variant, scFv),表達(dá)并初步探討其生物學(xué)功能 方法：以A8單抗輕重鏈可變區(qū)基因?yàn)槟０?通過(guò)重疊延伸PCR的方法構(gòu)建scFv的基因片段,同時(shí)引入不同的連接肽(Linker)序列,(G4S)3或者p2A,拼接得到多種形式的scFv片段。通過(guò)原核表達(dá)體系快速驗(yàn)證所構(gòu)建單鏈抗體基因片段表達(dá)產(chǎn)物的活性,并且構(gòu)建真核表達(dá)載體。脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO),潮霉素加壓篩選,篩選穩(wěn)定表達(dá)抗Ap寡聚體的單鏈抗體細(xì)胞株。通過(guò)間接ELISA和斑點(diǎn)印跡分析所得抗Aβ寡聚體scFv的抗原識(shí)別能力,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究所得scFv的細(xì)胞保護(hù)作用以及超微病理改變。 結(jié)果：成功獲得了scFv的3個(gè)基因片段,VL-(G4S)3-VH、VH-(G4S)3-VL和VL-p2A-VH。選取前2個(gè)基因片段構(gòu)建原核表達(dá)載體,獲得30kD的目的蛋白,經(jīng)過(guò)鎳親和層析純化,Western blot結(jié)果顯示純化的scFv正確表達(dá)；間接ELISA結(jié)果表明VH-(G4S)3-VL滴度為1：32000,VL-(G4S)3-VH滴度為1：8000。成功構(gòu)建3個(gè)真核表達(dá)載體(pSecTag2/HygroA-VL-(G4S)3-VH、pSecTag2/HygroA-VH-(G4S)3-VL和pSecTag2/HygroA-VL-p2A-VH);獲得了2株穩(wěn)定表達(dá)scFv的細(xì)胞株Hela-VL-p2A-VH(?)(?)CHO-VL-(G4S)3-VH。同接ELISA和斑點(diǎn)印跡結(jié)果表明所分泌的細(xì)胞上清具有抗原識(shí)別能力,體外實(shí)驗(yàn)顯示其具有阻斷和抑制Aβ42寡聚體的細(xì)胞毒性作用。其中一細(xì)胞株Hela-VL-p2A-VH較CHO-VL-(G4S)3-VH表達(dá)量和識(shí)別能力相對(duì)強(qiáng)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了Aβ寡聚體單鏈抗體表達(dá)載體,通過(guò)原核和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)正確表達(dá)；建立了2株穩(wěn)定表達(dá)所述單鏈抗體的細(xì)胞株；所分泌的細(xì)胞上清具有抗原識(shí)別能力,能夠阻斷Ap寡聚體的細(xì)胞毒性作用,為進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: Alzheimer's disease (Alzheimer's disease, AD) is one of the most common neurodegenerative diseases that cause dementia in the elderly. There is no effective treatment for Alzheimer's disease. Beta amyloid peptide (P-amyloid peptide,) A 尾) oligomer is the early initiation factor of AD. In this study, based on Ap oligomer specific monoclonal antibody A8, the expression of single chain antibody (single chain fragmen variant, scFv), was constructed and its biological function was preliminarily studied: the variable region of light and heavy chain of monoclonal antibody A8 was used as template. The gene fragment of scFv was constructed by overlapping extension of PCR. At the same time, different ligated peptide (Linker) sequences, (G4S) 3 or p2A were introduced, and various forms of scFv fragments were obtained by splicing together. The activity of the expressed product of scFv gene fragment was verified by prokaryotic expression system, and the eukaryotic expression vector was constructed. Human cervical cancer cell line (Hela) and Chinese hamster ovarian cell line (CHO), were transfected with lipofectamine to screen the single chain antibody cell line stably expressing anti-Ap oligomer. The antigen recognition ability of anti-A 尾 oligomer scFv was analyzed by indirect ELISA and dot blot analysis. The cell protection and ultrastructural changes of scFv were studied by in vitro experiments. Results: three scFv gene fragments, VL- (G4S) 3VH, VH-(G4S) 3-VL and VL-p2A-VH., were successfully obtained. The first two gene fragments were selected to construct the prokaryotic expression vector, and the target protein of 30kD was obtained. The purification of, Western blot by nickel affinity chromatography showed that the purified scFv was expressed correctly. The indirect ELISA results showed that the titers of VH- (G4S) 3-VL and VL- (G4S) 3-VH were 1? 32000 and 1? 8000, respectively. Three eukaryotic expression vectors (pSecTag2/HygroA-VL- (G4S) 3VH, pSecTag2 / Hygro VH-(G4S) 3-VL and pSecTag2/HygroA-VL-p2A-VH) were constructed successfully. Two Hela-VL-p2A-VH (?) CHO-VL- (G4S) 3 VH. stably expressing scFv were obtained. The results of co-linking ELISA and dot blot showed that the secreted supernatant had the ability of antigen recognition. In vitro experiments showed that it could block and inhibit the cytotoxicity of A 尾 42 oligomer. The expression and recognition ability of one cell line Hela-VL-p2A-VH was stronger than that of CHO-VL- (G4S) 3-VH. Conclusion: the A 尾 oligomer single chain antibody expression vector was successfully constructed and expressed correctly by prokaryotic and mammalian cell systems, and two cell lines stably expressing the single chain antibody were established. The secreted supernatant has the ability of antigen recognition, which can block the cytotoxicity of Ap oligomers and lay a foundation for further application.
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2448625