發(fā)布時間：2019-02-14 13:24

【摘要】：目的：(1)利用全基因組DNA甲基化芯片(The Illumina Infinium Human Methylation450),檢測酒依賴(alcohol dependence, AD)患者及其未患病同胞全基因組水平DNA甲基化程度,篩選出兩者之間甲基化程度具有差異的位點,探討這些差異性位點所在基因甲基化狀態(tài)和酒依賴之間的關(guān)聯(lián)。利用焦硫酸測序技術(shù),對某些甲基化程度差異性位點進行驗證分析,比較芯片結(jié)果與焦硫酸測序結(jié)果的相關(guān)性,增加可信度。(2)采用病例對照放大樣本量分析高差異程度基因,初步了解表觀遺傳在酒依賴病理機制中的作用和意義。 對象與方法：1.以精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版(Diagnostic and Statistical Manual of mental disorder-Ⅳ, DSM-Ⅳ)軸I障礙定式臨床檢查(Structured Clinical Interview for DSM-IV Axis I Disorders, SCID-Ⅰ)為診斷標準,將診斷為酒依賴者招募為病例組,并以酒精依賴性疾患識別測驗量表(The Alcohol Use Disorders Identification Test, AUDIT)評定病例組酒依賴嚴重程度,應(yīng)用生活事件量表(LES)、 Wheatley應(yīng)激量表了解負性生活事件及出現(xiàn)酒依賴的可能應(yīng)激因素；以與病例組年齡、文化程度、地域相匹配的原則招募健康對照組；同時,在知情同意的基礎(chǔ)上,選取酒依賴者家庭中一個尚未出現(xiàn)酒依賴(患病)狀態(tài)的同胞納入未患病同胞對組。本課題共招募兩組研究對象。一組是AD及未患病同胞對10對,均為男性。另一組是病例組(63例)和健康對照組(65例),均為男性。所有入組研究對象均來自新鄉(xiāng)市市區(qū)及縣區(qū)。2.抽取所有研究對象外周靜脈抗凝血8～10ml,利用DNA提取試劑盒(Qiagen,德國)提取各樣本基因組DNA,并對基因組DNA進行亞硫酸轉(zhuǎn)化處理及PCR擴增。利用全基因組甲基化芯片(The Illumina Infinium Human Methylation450)對10對AD同胞對進行基因組DNA甲基化檢測分析并得出原始數(shù)據(jù)。3.運用BeadStudio Methylation Module v3.2軟件分析數(shù)據(jù)。甲基化程度的高低依據(jù)掃描回饋結(jié)果average Beta值(AVB,反映樣本CpG位點甲基化程度,數(shù)值越大,越趨近于1,甲基化程度越高),根據(jù)|DiffScore|≤20進行甲基化程度差異性位點的篩選。4.通過焦硫酸測序技術(shù),利用10對同胞對(與全基因組DNA甲基化芯片檢測分析對象相同)外周血DNA,檢測GABRP、ALDH1L2、DBH、及GAD1基因甲基化程度,并與芯片結(jié)果進行相關(guān)分析,觀察芯片結(jié)果與焦硫酸測序結(jié)果的相符情況,驗證芯片技術(shù)的可靠性。5.運用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery6.7(DAVID; http://abcc.ncifcrf.gov)、Gene Ontology (GO; http://www.geneontology.org/)和the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; http://www. genome.jp/kegg/)對差異性位點進行相關(guān)通路分析。6.通過焦硫酸測序技術(shù),利用病例組(63例,不包括上述10對同胞對中的酒依賴患者)與健康對照組(65例)外周血DNA,對SSTR4基因和GABRP的差異性位點進行甲基化狀態(tài)檢測分析,驗證基于同胞對的分析結(jié)果。 結(jié)果：1.臨床研究(1)AD平均年齡為(44.9±5.9)歲,未患病同胞平均年齡為(44.2±7.2)歲,兩組年齡無顯著性差異(P0.05)。病例組年齡(39.1±7.3)歲,健康對照組年齡(39.6±8.1)歲,兩組年齡無顯著性差異(P0.05)。(2)10對酒依賴同胞對在AUDIT、 LES及Wheatley應(yīng)激量表評分的差異性均具有統(tǒng)計學(xué)意義,AUDIT (t=8.246, P0.05), LES (t=5.453, P0.05), Wheatley應(yīng)激量表(t=7.981,P0.05)。(3)63例酒依賴患者與65例健康對照在AUDIT. LES及Wheatley應(yīng)激量表評分的差異性均具有統(tǒng)計學(xué)意義,AUDIT (t=16.301, P0.05), LES (t=14.440, P0.05), Wheatley應(yīng)激量表(t=21.779,P0.05)。 2.10對酒依賴同胞對全基因組甲基化芯片檢測結(jié)果及驗證 通過芯片檢測分析及結(jié)果分析,共有865個低甲基化位點和716個高甲基化位點,這些位點涉及到827個已知基因。最高甲基化位點位于GABRP基因,最低甲基化位點位于SSTR4基因。10對同胞對焦硫酸測序結(jié)果與芯片結(jié)果相關(guān)性較好,GABRP基因、ALDH1L2、 GAD1及DBH基因的R2依次為：0.998,0.954,0.986,0.996,顯示芯片檢測結(jié)果可靠。 3.生物學(xué)通路分析 通過GO分析,這些差異性位點參與13條生物學(xué)過程、19條分子功能和20條分子構(gòu)成。通過KEGG分析,130個包含差異位點的基因中,33個基因?qū)儆诖x通路。 4、病例對照驗證分析 病例組SSTR4基因與對照組SSTR4基因的甲基化程度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.723,P0.05),并且病例組SSTR4基因的CG%比例低于對照組。病例組GABRP基因與對照組GABRP基因的甲基化程度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.622,P0.05),并且病例組GABRP基因的CG%比例高于對照組。這與芯片結(jié)果相同,兩組方法的結(jié)果比較相符,相互驗證。 結(jié)論：1.男性酒依賴患者與同胞對及健康對照相比,遭遇較多負性生活事件及有較高的應(yīng)激水平,說明環(huán)境因素在酒依賴的形成與維持過程中起到一定作用。 2.男性酒依賴患者存在全基因組水平DNA甲基化異常,共有865個低甲基化位點和716個高甲基化位點,這些位點涉及到827個已知基因。差異性甲基化位點參與了許多條生物學(xué)通路。DNA甲基化變化可能在酒精使用障礙病理機制中起到重要作用。 3.最高甲基化位點位于GABRP基因,最低甲基化位點位于SSTR4基因。SSTR4基因是新發(fā)現(xiàn)的可能與酒依賴相關(guān)的基因,它的甲基化程度的改變可能與酒依賴有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.6

【參考文獻】

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本文編號：2422242