【摘要】：研究背景和研究目的： 阿爾茨海默病(Alzheimer,s disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為記憶、認知功能障礙。AD在病理學(xué)表現(xiàn)主要包括神經(jīng)細胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)和細胞外淀粉樣斑。淀粉樣斑的主要成分是β-淀粉樣蛋白（Aβ）的肽類物質(zhì)在細胞外沉積。Aβ是由β淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶作用，產(chǎn)生一系列長短不等的Aβ和AICD。Aβ能夠引起神經(jīng)棘突丟失、神經(jīng)可塑性抑制、細胞凋亡等，因此，抑制或減少Aβ的產(chǎn)生是目前AD治療的一個重要方向。 β-分泌酶是淀粉樣途徑的主要限速酶，BACE1作為(beta-site APP-cleavingenzyme1)主要限速酶，在Aβ產(chǎn)生過程中的起關(guān)鍵作用，在大腦中高度表達。研究表明在AD患者腦中BACE1水平以及活性明顯升高。所以如何調(diào)控BACE1以及減少Aβ的產(chǎn)生是AD研究領(lǐng)域的一個研究熱點。 近年越來越多的研究表明，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）在AD的病理過程中起著重要作用。可以通過調(diào)控α-、β-和γ-分泌酶的活性來調(diào)節(jié)腦內(nèi)APP的代謝，進而影響Aβ產(chǎn)生。GPR50作為GPCRs家族一員，是一種G蛋白偶聯(lián)孤獨受體，GPR50在人腦切片海馬齒狀核位置有表達，與神經(jīng)元NOGO-A相互作用促進神經(jīng)軸突生長，而NOGO家族分子在Aβ產(chǎn)生中起著重要作用。結(jié)合以上研究背景我們推測GPR50可能參與AD的發(fā)病機制，此研究探討GPR50對β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的作用機制，為AD的藥物研發(fā)以及診療提供科學(xué)依據(jù)。 研究內(nèi)容： 1、GPR50對Aβ產(chǎn)生影響以及機制。 2、GPR50對BACE1影響以及作用機制。 方法： 1、細胞存活率的檢測：利用MTT比色法檢測細胞存活率。 2、GPR50、BACE1、APP在人腦或細胞的分布以及共定位，采用免疫熒光技術(shù)結(jié)合顯微鏡技術(shù)檢測。 3、GPR50mRNA、BACE1mRNA的水平表達：利用RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳相結(jié)合檢測。 4、細胞外Aβ40、Aβ42濃度檢測：利用ELISA方法參照說明書進行檢測。 5、蛋白表達水平檢測：使用Western blot法檢測GPR50、BACE1、APP、CTFs、以及溶酶體等。 6、BACE1活性：依據(jù)β-Secretase Activity Assay Kit說明書進行檢測。 7、GPR50與BACE1、GPR50與APP蛋白相互關(guān)系：采用免疫共沉淀法研究蛋白與蛋白相互關(guān)系。 結(jié)果： 1、GPR50對Aβ產(chǎn)生的調(diào)控作用 1.1GPR50抑制Aβ產(chǎn)生和APP的代謝。 1.2GPR50質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HEK-APP細胞，，抑制Aβ40和Aβ42產(chǎn)生，并且抑制作用表現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。 1.3在原代培養(yǎng)神經(jīng)元中，轉(zhuǎn)染GPR50siRNA沉默GPR50表達后Aβ產(chǎn)生明顯增加。 1.4GPR50通過調(diào)控β-分泌酶抑制Aβ產(chǎn)生。過表達GPR50能夠減少β-CTF的表達水平,而α-CTF表達水平無明顯改變。 2、GPR50對BACE1的調(diào)控作用與機制 2.1GPR50與BACE1共定位并且相互作用。 2.2在HEK-293細胞中過表達GPR50，BACE1活性和蛋白水平明顯降低。過表達GPR50不影響HEK-293細胞以及神經(jīng)元的BACE1mRNA水平表達。 2.3HEK-293細胞用溶酶體抑制劑氯化銨或氯喹處理后，過表達GPR50能夠加速BACE1蛋白的降解。 2.4CHO細胞用氯喹預(yù)處理后，過表達GPR50-FLAG以及BACE1-HA能夠使BACE1和LAMP-1共定位的比率顯著性增加；沉默GPR50表達后BACE1和LAMP-1共定位比率下降。 結(jié)論： GPR50通過抑制BACE1酶活性以及蛋白水平，促進BACE1蛋白轉(zhuǎn)運進溶酶體內(nèi)和加速蛋白在溶酶體降解來減少Aβ生成，因此GPR50與AD的發(fā)病機制有關(guān)，可以作為AD治療的藥物靶點。
[Abstract]:Background and purpose of the study: Alzheimer's disease (AD) is a common neurodegenerative disease, and its clinical manifestations are memory and cognitive function. Obstacles. AD in the pathology mainly includes the nerve fiber entanglement and the extracellular starch in the nerve cell The main component of the amyloid plaques is the peptide of the P-amyloid (A-type) in the outside of the cell. The effect of AICD on the loss of the spinous process of the nerve, the inhibition of the plasticity of the nerve, the apoptosis of the cells and so on. Therefore, inhibition or reduction of the generation of A-type is an important part of the current AD treatment Direction. The enzyme is the main speed-limiting enzyme of the starch-like pathway, and BACE1 is the main speed-limiting enzyme of the beta-site APP-cleaning enzyme. It plays a key role in the production of A-enzyme and is in the brain. The expression of BACE1 in the brain of AD patients and the activity of BACE1 in the brain of AD patients. So how to control BACE1 and reduce the generation of A-type is one of the areas of AD research. In recent years, more and more studies have shown that G-protein-coupled receptor (GPCR) has been in the process of AD. It plays an important role in the process. It can regulate the metabolism of APP in the brain by regulating the activity of the P-, The GPR50, as a member of the GPCRs family, is a G-protein-coupled receptor, and the GPR50 is expressed in the dentate nucleus of the hippocampus of the human brain. In combination with the above research background, it is suggested that the GPR50 may be involved in the pathogenesis of AD, this study is to explore the mechanism of action of GPR50 on the amyloid-like protein, and to develop and develop the drug for AD. Diagnosis and treatment providing section Basis of study. Study content: 1, GP R50 impact on A-level and mechanism. 2, GP R50 Effects on BACE1 and Mechanism of Action. Method: 1, fine Detection of cell viability: Cell viability was detected using the MTT assay. 2, GPR50, BACE1, APP were in the human brain or cell The distribution and co-location of GPR50mRNA and BACE1mR were detected by immunofluorescent techniques. Horizontal expression of NA: combined with RT-PCR and agarose gel electrophoresis. A-40, A-42 concentration detection: detection by ELISA method with reference to the specification. 5. Detection of protein expression level: use of the Westin The expression of GPR50, BACE1, APP, CTFs and lysosomes were detected by n-blot. Sex: Test according to the Manual-Secrease Activity Assay Kit instructions. 7, GPR50 vs. (BAC) E1, GPR50 and APP protein cross-correlation System: The relationship between protein and protein was studied by the method of immunoprecipitation. Results: 1. The control effect of GPR50 on A-antigen was 1. 1GPR50 inhibited the production of A and the metabolism of APP. 1. The 2GPR50 plasmid was transfected into HEK-APP cells to inhibit the production of A-antigen 40 and A-antigen 42, and to inhibit the production the expression dose-dependent effect. 1. 3 in primary cultured neurons in that expression of the GPR50 siRNA-silent GPR50, a significant increase in the level of A-antigen was found. The GPR50 is produced by the regulation of the inhibition of A-enzyme by the hormone-secreting enzyme. Over-expression of the GPR50 can reduce the level of expression of the F-CTF, The level of F-CTF expression did not change significantly. The regulation and mechanism of GPR50 on BACE1 2. 1GPR50 co-located with BACE1 and interacts. 2. 2 in HEK-293 The expression of GPR50, BACE1 activity and protein level in the cells was significantly reduced. The overexpression of GPR50 did not affect the HEK-293 cells and the gods. Overexpression of GPR50 could accelerate the degradation of BACE1 protein after the treatment with a lysosome inhibitor of BACE1mRNA. R50-FLAG and BACE1-HA significantly increased the ratio of BACE1 and LAMP-1 co-localization; the ratio of BACE1 and LAMP-1 co-location decreased after silence GPR50 expression. Conclusion: GPR50 is inhibited by inhibition of B
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【共引文獻】

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本文編號：2339277