【摘要】：血管性癡呆是發(fā)展中國家癡呆首要原因，迄今為止，人類還未找到治療血管性癡呆行之有效的方法，防治手段十分有限。慢性腦缺血是研究血管性癡呆發(fā)病機(jī)理的重要組成部分，被認(rèn)為是血管性癡呆、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、Binswanger病發(fā)病中的一個共同病理過程，可導(dǎo)致持久性進(jìn)展性認(rèn)知損傷，但其導(dǎo)致認(rèn)識損害的病理生理機(jī)制仍不完全清楚，是丞待解決的醫(yī)學(xué)難題。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)功能失調(diào)及氧化應(yīng)激在腦缺血、阿爾茨海默病等變性病所致癡呆中的重要作用已得到公認(rèn)，，臨床上一些抗氧化劑已在癡呆的治療中得到獲益。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)控制著細(xì)胞的生長、分化和死亡，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性。目前已知眾多疾病都是由信號通路的缺陷所致。病理狀態(tài)下信號通路的重構(gòu)將有助于人們更多的了解疾病的病因和發(fā)病過程，同時提供了發(fā)現(xiàn)治療疾病新方法的機(jī)會。 SIRT1（沉默信息調(diào)節(jié)因子1）是NAD+依賴性蛋白脫乙酰酶，在細(xì)胞分化、衰老、凋亡、生理節(jié)律、代謝調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激等多種重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。最近的氧糖剝奪體外實驗、急性腦缺血和缺血預(yù)處理動物實驗表明SIRT1通過抗氧化、抗炎、減少凋亡等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并有證據(jù)表明SIRT1是控制出生后血管生長的內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，提示它可能在慢性腦缺血狀態(tài)仍發(fā)揮重要作用。 為明確SIRT1信號通路在慢性腦缺血中的作用，本研究通過雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法（雙血管阻斷，即2-VO）建立了慢性腦缺血的大鼠癡呆模型，利用Morris水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，通過免疫組化和Wstern blot法檢測慢性缺血時SIRT1在不同時間點(diǎn)的表達(dá)變化，并利用激活劑白藜蘆醇及抑制劑EX-527對模型進(jìn)行干預(yù)，利用免疫組化、實時定量PCR及Wstern blot檢測SIRT1信號通路下游底物磷酸化FOXO3α（Ser253）、PGC-1α表達(dá)水平變化，及SIRT1信號通路對氧化應(yīng)激的影響，最終為SIRT1信號通路的抗血管性認(rèn)知損傷作用提供更多的理論依據(jù)。1慢性腦缺血大鼠模型制備及認(rèn)知功能評價選用健康雄性Wistar大鼠，鼠齡2-3個月，體重260-300克，隨機(jī)分為假手術(shù)6周組和慢性腦缺血6周組。采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎(2-VO)法建立大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙模型，利用Morris水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。定位航行試驗中檢測大鼠逃避潛伏期，每天進(jìn)行2次試驗，2次試驗中間間隔15分鐘，連續(xù)進(jìn)行試驗5天。第5天在定位航行試驗結(jié)束后開始進(jìn)行空間探索試驗，檢測大鼠跨越原平臺所在象限時間。于2-VO術(shù)后6周對大鼠斷頭取腦，留取額葉皮層及海馬組織，通過HE染色法進(jìn)行病理學(xué)評估。實驗結(jié)果顯示2-VO大鼠死亡率為22.7%，與文獻(xiàn)報道相近。術(shù)后6周定位航行試驗顯示，假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期迅速下降并進(jìn)入平臺期，對隱藏平臺的空間定位主要花費(fèi)在前2天，而慢性腦缺血組則花費(fèi)了4天時間學(xué)會尋找隱藏的平臺，而且其學(xué)習(xí)能力并不穩(wěn)定，表現(xiàn)為第5天的時候花費(fèi)了更多的時間尋找隱藏的平臺�？臻g探索試驗中慢性腦缺血組大鼠跨越平臺時間明顯小于假手術(shù)組。HE染色鏡下可見慢性腦缺血組大鼠額葉皮層和海馬CA1區(qū)內(nèi)散在缺血性改變，正常神經(jīng)元數(shù)目減少，可見神經(jīng)細(xì)胞脫失，組織排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則排列紊亂，出現(xiàn)神經(jīng)元變性和死亡，散在嗜伊紅細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞核固縮，核仁顯示不清，核膜境界不清。假手術(shù)組大鼠組織結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞排列整齊，無神經(jīng)元凋亡、變性及壞死表現(xiàn)，胞質(zhì)和核仁顯示正常。以上結(jié)果提示本實驗成功建立大鼠慢性腦缺血致認(rèn)知損傷模型，雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法可以較好的顯示慢性腦缺血的行為學(xué)和病理學(xué)變化，并可造成顯著認(rèn)知損傷，模型可靠。2慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)SIRT1表達(dá)及氧化應(yīng)激變化 將健康雄性Wistar大鼠分組如下：（1）假手術(shù)6周組（2）假手術(shù)9周組（3）假手術(shù)12周組（4）慢性腦缺血6周組（5）慢性腦缺血9周組（6）慢性腦缺血12周組。利用2-VO法建立慢性腦缺血模型，對額葉皮層和海馬組織利用免疫組化染色及Western blot檢測大鼠SIRT1蛋白表達(dá)水平。將海馬和額葉制成10％的勻漿，離心后取上清液按試劑盒說明書進(jìn)行SOD、MDA水平測定。 Morris水迷宮試驗顯示，在2-VO術(shù)后的6周、9周和12周，慢性腦缺血大鼠認(rèn)知損傷隨著缺血時間的延長呈現(xiàn)動態(tài)變化。術(shù)后6周定位航行試驗顯示慢性腦缺血大鼠在試驗第2天、第3天和第5天逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組。術(shù)后9周，在試驗第2天至5天，慢性腦缺血大鼠的逃避潛伏期均顯著長于假手術(shù)組，并在試驗第4天即出現(xiàn)了逃避潛伏期再次延長。術(shù)后12周，慢性腦缺血大鼠逃避潛伏期在整個試驗周期均明顯高于假手術(shù)組�？臻g探索試驗中3個時間點(diǎn)慢性腦缺血大鼠跨越原平臺所在象限時間均明顯小于假手術(shù)組，并隨著缺血時間的延長逐漸縮短。慢性腦缺血HE染色病理切片顯示隨著缺血時間的延長，額葉和海馬內(nèi)神經(jīng)元脫失及變性壞死逐漸增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管增生逐漸增加，組織結(jié)構(gòu)紊亂，排列不規(guī)則。細(xì)胞嚴(yán)重變形，胞質(zhì)內(nèi)有不均勻空泡逐漸增加，核固縮現(xiàn)象增多，白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)小軟化灶。免疫組化結(jié)果顯示SIRT1蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要表達(dá)于細(xì)胞核。2-VO術(shù)后SIRT1陽性細(xì)胞比率明顯減少，以缺血6周組最明顯。Western blot的檢測結(jié)果顯示2-VO術(shù)后6周、9周、12周SIRT1的蛋白水平均低于相應(yīng)對照組，6周時SIRT1蛋白降低最明顯，9周和12周時略有增加，12周高于9周，慢性缺血組各時間點(diǎn)之間SIRT1蛋白水平比較差異顯著。2-VO術(shù)后6周、9周及12周氧化應(yīng)激檢測結(jié)果顯示，慢性腦缺血時抗氧化物質(zhì)SOD降低而脂質(zhì)氧化標(biāo)志物MDA升高，提示慢性腦缺血時體內(nèi)抗氧化能力降低、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。慢性腦缺血組與假手術(shù)組之間SOD與MDA的顯著差異均僅發(fā)生在腦缺血6周。以上結(jié)果提示2-VO模型可造成大鼠進(jìn)行性認(rèn)知損害，有效模擬血管性癡呆的臨床經(jīng)過。SIRT1活性在慢性腦缺血受到抑制，參與慢性腦缺血所致認(rèn)知損傷的發(fā)生發(fā)展過程。慢性腦缺血時氧化應(yīng)激反應(yīng)主要發(fā)生在缺血6周的早期階段，這為本實驗后續(xù)選擇氧化應(yīng)激干預(yù)時間點(diǎn)提供了依據(jù)。3慢性腦缺血腦內(nèi)SIRT1信號通路對大鼠認(rèn)知功能及氧化應(yīng)激的影響 健康雄性Wistar大鼠實驗分組如下：（1）假手術(shù)6周組（2）慢性腦缺血6周組（3）白藜蘆醇+慢性腦缺血6周組（4）白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血6周組（5）EX-527+慢性腦缺血6周組。白藜蘆醇通過腹腔注射的方式進(jìn)行給藥，給藥劑量為每天50mg/Kg。EX-527每天向側(cè)腦室內(nèi)注射5μg。于2-VO術(shù)后6周對各組大鼠利用Morris水迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測，實時定量PCR及Western blot檢測SIRT1、FOXO3α、PGC-1α表達(dá)水平。按試劑盒說明書對腦組織勻漿進(jìn)行SOD、MDA水平測定。 Morris水迷宮行為學(xué)試驗結(jié)果顯示，定位航行試驗中慢性腦缺血大鼠在接受白藜蘆醇治療后，試驗第2天、第3天和第5天逃避潛伏期明顯縮短，空間探索試驗中跨越原平臺所在象限時間明顯延長；慢性腦缺血大鼠接受SIRT1抑制劑EX-527治療后定位航行試驗第2至5天逃避潛伏期均明顯延長，空間探索試驗中跨越原平臺所在象限時間明顯縮短；同時給予白藜蘆醇及EX-527治療的大鼠，與單純慢性腦缺血大鼠對比，試驗第1天、第2天和第5天組逃避潛伏期變化不明顯，第3天及第4天逃避潛伏期明顯延長，空間探索試驗中跨越原平臺所在象限時間則明顯縮短。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示FOXO3α的mRNA水平在慢性腦缺血時降低，慢性腦缺血組與假手術(shù)組比較FOXO3α的mRNA水平差異顯著。白藜蘆醇干預(yù)后FOXO3α的mRNA水平升高，白藜蘆醇+慢性腦缺血組與單純慢性腦缺血組比較FOXO3α的mRNA水平差異顯著。EX-527+慢性腦缺血組及白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組大鼠FOXO3α的mRNA水平較單純慢性腦缺血組明顯下降，并明顯低于白藜蘆醇+慢性腦缺血組。SIRT1與PGC-1α的mRNA在各組之間的表達(dá)水平無明顯差異。額葉及海馬CA1區(qū)的免疫組化結(jié)果顯示，SIRT1蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。假手術(shù)組可見一定程度的SIRT1蛋白陽性表達(dá)。2-VO術(shù)后額葉皮層和海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列分散，胞體變形。慢性腦缺血組SIRT1蛋白表達(dá)與假手術(shù)組對比明顯減低，而白藜蘆醇+慢性腦缺血組及白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組SIRT1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，EX-527+慢性腦缺血組與單純慢性腦缺血組對比SIRT1的蛋白陽性表達(dá)無明顯差異。磷酸化的FOXO3α（Ser253）蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。假手術(shù)組內(nèi)FOXO3α蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)豐富，細(xì)胞漿表達(dá)罕見，慢性腦缺血組大鼠FOXO3α蛋白神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)顯著減少，細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)均有FOXO3α蛋白表達(dá)，以細(xì)胞核為著，變性的神經(jīng)元無明顯表達(dá)。白藜蘆醇+慢性腦缺血組大鼠額葉皮層和海馬CA1區(qū)內(nèi)變性神經(jīng)元及正常神經(jīng)元均有FOXO3α蛋白表達(dá)，主要見于細(xì)胞核，較2-VO組大鼠表達(dá)顯著增加。額葉皮層內(nèi)EX-527+慢性腦缺血組及白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組與單純2-VO組對比FOXO3α表達(dá)變化不明顯，但顯著低于白藜蘆醇+慢性腦缺血組。海馬CA1區(qū)EX-527+慢性腦缺血組FOXO3α表達(dá)水平明顯低于單純慢性腦缺血組，白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組與單純慢性腦缺血組對比FOXO3α表達(dá)變化不明顯，但顯著低于白藜蘆醇+慢性腦缺血組。假手術(shù)組PGC-1α蛋白表達(dá)豐富表達(dá)，細(xì)胞核和細(xì)胞漿均表達(dá)，細(xì)胞漿可見較多表達(dá)。慢性腦缺血組神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞腫脹明顯，PGC-1α表達(dá)明顯減少，細(xì)胞核及細(xì)胞漿均見表達(dá)，胞漿表達(dá)相對明顯，部分在胞膜下表達(dá)。白藜蘆醇干預(yù)后PGC-1α表達(dá)增加，主要出現(xiàn)在細(xì)胞核。EX-527+慢性腦缺血組及白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組PGC-1α總體表達(dá)減少，主要見于胞漿表達(dá)，與白藜蘆醇組比較差異顯著。Western blot結(jié)果顯示慢性腦缺血組SIRT1蛋白水平表達(dá)明顯低于假手術(shù)組，白藜蘆醇+慢性腦缺血組及白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組SIRT1蛋白水平明顯高于單純慢性腦缺血組，EX-527+慢性腦缺血組SIRT1蛋白水平與單純慢性腦缺血組對比無明顯差異。磷酸化FOXO3α（Ser253）蛋白在慢性腦缺血組表達(dá)與假手術(shù)比較明顯降低，白藜蘆醇+慢性腦缺血組磷酸化FOXO3α（Ser253）的蛋白水平升高，與單純慢性腦缺血組比較差異顯著。EX-527+慢性腦缺血組及白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組磷酸化FOXO3α（Ser253）的蛋白水平與單純慢性腦缺血組比較下降不明顯，但明顯低于白藜蘆醇+慢性腦缺血組。慢性腦缺血組PGC-1α蛋白水平明顯低于假手術(shù)組。白藜蘆醇+慢性腦缺血組PGC-1α蛋白水平明顯高于單純慢性腦缺血組，EX-527+慢性腦缺血組PGC-1α蛋白水平明顯低于單純慢性腦缺血組。白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組PGC-1α蛋白水平明顯低于單純慢性腦缺血組。2-VO術(shù)后6周各組間氧化應(yīng)激檢測結(jié)果顯示，慢性腦缺血組SOD水平降低，而MDA水平升高，與假手術(shù)組比較差異顯著。與單純慢性腦缺血組比較，白藜蘆醇+慢性腦缺血組SOD水平升高，MDA水平降低，組間比較差異顯著。與單純慢性腦缺血組比較，EX-527+慢性腦缺血組SOD表達(dá)水平降低，MDA表達(dá)水平升高，組間比較差異顯著。白藜蘆醇+EX-527+慢性腦缺血組大鼠腦內(nèi)MDA水平明顯高于單純慢性腦缺血組，SOD水平兩組之間比較差異不顯著。 以上結(jié)果提示在慢性腦缺血狀態(tài)下，SIRT1以及其下游底物PGC-1α、FOXO3α表達(dá)受到抑制，SIRT1可以對FOXO3α從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，而對PGC-1α的表達(dá)調(diào)節(jié)主要發(fā)生在蛋白水平。SIRT1-PGC-1α/FOXO3α信號通路影響慢性腦缺血大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性提高可以增強(qiáng)大鼠的抗氧化應(yīng)激的能力，有效改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知損傷。白藜蘆醇對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知損傷的改善作用，與增強(qiáng)SIRT1信號通路介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的能力有關(guān)，本研究為其用于血管性認(rèn)知損傷的防治提供了實驗室證據(jù)，有望成為血管性認(rèn)知損傷新的治療藥物之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

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