【摘要】：研究背景 阿爾茨海默�。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種以慢性進(jìn)行性癡呆為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，是老年性癡呆最常見(jiàn)的原因之一，其發(fā)病率隨年齡的增高而不斷增高，給社會(huì)家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，AD在診斷、治療等方面仍然比較滯后，本課題通過(guò)對(duì)目前比較熱門的一些技術(shù)方法和治療手段的探討，來(lái)尋找未來(lái)可能應(yīng)用于AD的方法和方向。在AD的診斷方面，磁共振成像（magnetic resonanceimaging，MRI）是一種很有前景的檢測(cè)AD中β淀粉樣蛋白（β-amloid，Aβ）沉積的診斷技術(shù)，使用磁共振對(duì)比劑既能夠提供Aβ沉積的特異性成像以區(qū)分其他病理生理結(jié)構(gòu)，又能縮短成像時(shí)間。而在AD的治療方面，早期對(duì)血管功能的保護(hù)可能成為針對(duì)發(fā)病機(jī)理的治療新靶點(diǎn)，而晚期神經(jīng)元的丟失也可能通過(guò)細(xì)胞移植的方法進(jìn)行功能重建。 目的 1.開(kāi)發(fā)一種使用超小超順磁性氧化鐵（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）納米顆粒連接功能性蛋白的磁共振對(duì)比劑，從而給檢測(cè)Aβ沉積提供方法。 2.用于治療腦缺血的藥物丁苯酞，，具有內(nèi)皮保護(hù)作用，通過(guò)觀察其對(duì)Aβ?lián)p傷下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cerebral microvascular endothelial cells，CMECs）的作用，尋找丁苯酞用于AD治療的證據(jù)并進(jìn)行初步的機(jī)制探討。 3.神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞移植治療的最終應(yīng)用形式，但存在定向分化問(wèn)題。擬通過(guò)觀察與CMECs共培養(yǎng)后NSCs在正常條件下和損傷條件下的分化情況，尋找一種能夠促使移植治療應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的解決方案。 方法 1.磁共振對(duì)比劑由USPIO納米顆粒連接Aβ16-20（KLVFF）和跨膜蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（trans-activating transcriptor-protein transduction domain，Tat-PTD）組成，其中Aβ16-20是能特異性與Aβ沉積結(jié)合的探針，Tat-PTD能幫助對(duì)比劑穿過(guò)血腦屏障（brain bloodbarrier，BBB）。體外實(shí)驗(yàn)研究此對(duì)比劑的生物膜穿透性、生物毒性、與Aβ沉積的特異性結(jié)合能力以及對(duì)組織磁共振信號(hào)的影響；最終將其注射入AD轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)進(jìn)行活體磁共振成像及組織學(xué)驗(yàn)證。 2.建立CMECs原代培養(yǎng)方法并鑒定。使用不同濃度丁苯酞預(yù)處理CMECs后予以Aβ?lián)p傷，觀察其活性和凋亡率的變化，并進(jìn)一步觀察其分泌NO及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）水平的變化。 3.共培養(yǎng)原代CMECs和NSCs，觀察NSCs的生長(zhǎng)狀況，移除CMECs后將NSCs分別置于正常培養(yǎng)環(huán)境和缺糖缺氧（Oxygen-glucose deprivation，OGD）環(huán)境中分化以觀察分化比例。鼠胚成纖維細(xì)胞（mouse embryo fibroblast，MEF）與NSCs共培養(yǎng)作為對(duì)照組。 結(jié)果 1.Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20的蛋白連接效率達(dá)97.75%，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均顯示其能穿過(guò)生物膜，與Aβ沉積特異性結(jié)合，并能降低組織的磁共振信號(hào)，與未連接的Aβ16-20及Aβ1-40相比沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性作用。 2.成功建立了乳小鼠CMECs的原代培養(yǎng)方法，最終陽(yáng)性率可達(dá)95.5%。丁苯酞預(yù)處理后的Aβ?lián)p傷CMECs，細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，NO分泌增高，iNOS分泌及胞漿表達(dá)均增高，而eNOS分泌及胞漿含量未發(fā)現(xiàn)有顯著變化。 3.與CMECs共培養(yǎng)的NSCs數(shù)量更多，直徑更大，不論是在正常培養(yǎng)環(huán)境下還是在OGD環(huán)境下，神經(jīng)元分化比例均高于對(duì)照。 結(jié)論 1.本研究設(shè)計(jì)的磁共振對(duì)比劑能夠穿過(guò)BBB，并能通過(guò)磁共振檢測(cè)到AD動(dòng)物模型體內(nèi)的Aβ沉積，是一種很有潛力的AD診斷技術(shù)。此外，還有助于開(kāi)發(fā)和評(píng)估新的以減少Aβ沉積為目標(biāo)的AD藥物。 2.丁苯酞可能通過(guò)提高iNOS的表達(dá)和分泌，從而提高NO水平來(lái)對(duì)Aβ?lián)p傷的CMECs產(chǎn)生保護(hù)作用，且大劑量下保護(hù)作用更明顯和穩(wěn)定，故而有可能通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮功能而對(duì)AD產(chǎn)生治療作用。 3. CMECs能夠促進(jìn)NSCs的存活和增殖，不僅能促進(jìn)其在正常培養(yǎng)條件下，也能促進(jìn)其在損傷條件下更多的向神經(jīng)元分化。這為研究NSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療中的定向分化問(wèn)題提供了新證據(jù)。 創(chuàng)新點(diǎn) 1.創(chuàng)造性開(kāi)發(fā)出新型納米磁共振對(duì)比劑，既為AD臨床體內(nèi)診斷應(yīng)用打下基礎(chǔ)，也為新藥開(kāi)發(fā)研究提供了評(píng)估手段。 2.建立了一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)易、重復(fù)性好、純度高的CMECs原代培養(yǎng)方法。 3.通過(guò)AD發(fā)病機(jī)理的新觀點(diǎn)，探討在臨床上應(yīng)用于腦缺血的藥物丁苯酞用于AD治療的可能，為增加新的適應(yīng)癥提供一定的依據(jù)。 4.在細(xì)胞移植治療中的神經(jīng)干細(xì)胞定向分化問(wèn)題上，著重探討了在損傷環(huán)境中的分化狀況，更接近真實(shí)的移植狀況。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉愷鳴;遲路湘;魯向輝;何國(guó)祥;;大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年20期

2 王義寶;劉云會(huì);劉麗波;王萍;馬永會(huì);;大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其生物學(xué)行為初步探討[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2006年02期

3 梁朝峰;郭英;石德金;王輝;胡黎平;李文勝;葉卓鵬;李燕;;大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[J];中國(guó)病理生理雜志;2008年05期

本文編號(hào)：2298397