【摘要】：研究背景 阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種以慢性進行性癡呆為主要表現(xiàn)的神經退行性疾病，是老年性癡呆最常見的原因之一，其發(fā)病率隨年齡的增高而不斷增高，給社會家庭帶來了沉重的經濟負擔。然而，AD在診斷、治療等方面仍然比較滯后，本課題通過對目前比較熱門的一些技術方法和治療手段的探討，來尋找未來可能應用于AD的方法和方向。在AD的診斷方面，磁共振成像（magnetic resonanceimaging，MRI）是一種很有前景的檢測AD中β淀粉樣蛋白（β-amloid，Aβ）沉積的診斷技術，使用磁共振對比劑既能夠提供Aβ沉積的特異性成像以區(qū)分其他病理生理結構，又能縮短成像時間。而在AD的治療方面，早期對血管功能的保護可能成為針對發(fā)病機理的治療新靶點，而晚期神經元的丟失也可能通過細胞移植的方法進行功能重建。 目的 1.開發(fā)一種使用超小超順磁性氧化鐵（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）納米顆粒連接功能性蛋白的磁共振對比劑，從而給檢測Aβ沉積提供方法。 2.用于治療腦缺血的藥物丁苯酞，，具有內皮保護作用，通過觀察其對Aβ?lián)p傷下腦微血管內皮細胞（cerebral microvascular endothelial cells，CMECs）的作用，尋找丁苯酞用于AD治療的證據并進行初步的機制探討。 3.神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是中樞神經系統(tǒng)疾病細胞移植治療的最終應用形式，但存在定向分化問題。擬通過觀察與CMECs共培養(yǎng)后NSCs在正常條件下和損傷條件下的分化情況，尋找一種能夠促使移植治療應用于神經退行性疾病的解決方案。 方法 1.磁共振對比劑由USPIO納米顆粒連接Aβ16-20（KLVFF）和跨膜蛋白轉導結構域（trans-activating transcriptor-protein transduction domain，Tat-PTD）組成，其中Aβ16-20是能特異性與Aβ沉積結合的探針，Tat-PTD能幫助對比劑穿過血腦屏障（brain bloodbarrier，BBB）。體外實驗研究此對比劑的生物膜穿透性、生物毒性、與Aβ沉積的特異性結合能力以及對組織磁共振信號的影響；最終將其注射入AD轉基因小鼠來進行活體磁共振成像及組織學驗證。 2.建立CMECs原代培養(yǎng)方法并鑒定。使用不同濃度丁苯酞預處理CMECs后予以Aβ?lián)p傷，觀察其活性和凋亡率的變化，并進一步觀察其分泌NO及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）水平的變化。 3.共培養(yǎng)原代CMECs和NSCs，觀察NSCs的生長狀況，移除CMECs后將NSCs分別置于正常培養(yǎng)環(huán)境和缺糖缺氧（Oxygen-glucose deprivation，OGD）環(huán)境中分化以觀察分化比例。鼠胚成纖維細胞（mouse embryo fibroblast，MEF）與NSCs共培養(yǎng)作為對照組。 結果 1.Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20的蛋白連接效率達97.75%，體內、體外實驗均顯示其能穿過生物膜，與Aβ沉積特異性結合，并能降低組織的磁共振信號，與未連接的Aβ16-20及Aβ1-40相比沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性作用。 2.成功建立了乳小鼠CMECs的原代培養(yǎng)方法，最終陽性率可達95.5%。丁苯酞預處理后的Aβ?lián)p傷CMECs，細胞活性升高，凋亡率降低，NO分泌增高，iNOS分泌及胞漿表達均增高，而eNOS分泌及胞漿含量未發(fā)現(xiàn)有顯著變化。 3.與CMECs共培養(yǎng)的NSCs數(shù)量更多，直徑更大，不論是在正常培養(yǎng)環(huán)境下還是在OGD環(huán)境下，神經元分化比例均高于對照。 結論 1.本研究設計的磁共振對比劑能夠穿過BBB，并能通過磁共振檢測到AD動物模型體內的Aβ沉積，是一種很有潛力的AD診斷技術。此外，還有助于開發(fā)和評估新的以減少Aβ沉積為目標的AD藥物。 2.丁苯酞可能通過提高iNOS的表達和分泌，從而提高NO水平來對Aβ?lián)p傷的CMECs產生保護作用，且大劑量下保護作用更明顯和穩(wěn)定，故而有可能通過保護內皮功能而對AD產生治療作用。 3. CMECs能夠促進NSCs的存活和增殖，不僅能促進其在正常培養(yǎng)條件下，也能促進其在損傷條件下更多的向神經元分化。這為研究NSCs在中樞神經系統(tǒng)疾病的細胞治療中的定向分化問題提供了新證據。 創(chuàng)新點 1.創(chuàng)造性開發(fā)出新型納米磁共振對比劑，既為AD臨床體內診斷應用打下基礎，也為新藥開發(fā)研究提供了評估手段。 2.建立了一種經濟、簡易、重復性好、純度高的CMECs原代培養(yǎng)方法。 3.通過AD發(fā)病機理的新觀點，探討在臨床上應用于腦缺血的藥物丁苯酞用于AD治療的可能，為增加新的適應癥提供一定的依據。 4.在細胞移植治療中的神經干細胞定向分化問題上，著重探討了在損傷環(huán)境中的分化狀況，更接近真實的移植狀況。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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2 王義寶;劉云會;劉麗波;王萍;馬永會;;大鼠腦微血管內皮細胞的原代培養(yǎng)及其生物學行為初步探討[J];神經解剖學雜志;2006年02期

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本文編號：2298397