【摘要】：第一部分癲癇CDl小鼠前腦淀粉樣斑及tau病變相關(guān)蛋白表達 實驗原理與目的：以往顳葉癲癇人腦病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)等阿爾茨海默病(AD)樣病理改變。嚙齒類皮羅卡品癲癇模型能重建人顳葉癲癇的大部分病理學(xué)、異常腦電腦活動及癲癇行為學(xué)改變。本部分實驗擬采用CD1小鼠建立皮羅卡品癲癇模型。通過行為學(xué)、電生理及經(jīng)典組織學(xué)方法證實小鼠模型的成功建立。在此基礎(chǔ)上,觀察和確立與淀粉樣斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成相關(guān)的蛋白表達在癲癇小鼠腦內(nèi)的變化及其程度。 材料與方法：采用2月齡成年CD1小鼠,腹腔注射皮羅卡品誘導(dǎo)實驗性顳葉癲癇,對照組腹腔注射生理鹽水。在不同存活時間點(24-48小時,及7、14、30、60天)進行電生理和/或腦組織學(xué)處理。組織學(xué)與免疫組織化學(xué)染色比較癲癇和對照動物海馬和邊緣系統(tǒng)區(qū)域的細胞構(gòu)筑、軸突芽生,淀粉樣蛋白(Ap)及其生成酶貝塔分泌酶1(BACE1)、磷酸化tau和其他相關(guān)神經(jīng)元標記物表達和分布。 結(jié)果：行為學(xué)和電生理檢測證實皮羅卡品處理CD1小鼠表現(xiàn)復(fù)發(fā)性痙攣癲癇發(fā)作和海馬癇性放電。Timm染色和神經(jīng)肽(NPY)免疫組化證實癲癇小鼠CA3區(qū)苔蘚纖維末梢芽生。存活7天及以上癲癇動物尼氏染色顯示海馬CA1和CA3區(qū)細胞死亡。在存活7至60天組癲癇小鼠,貝塔分泌酶1(BACE1)上調(diào)伴隨苔蘚纖維及梨狀皮質(zhì)、杏仁核等亞區(qū)軸突芽生,以及局部樹突標志物MAP2免疫反應(yīng)缺失。癲癇小鼠未表現(xiàn)細胞外淀粉樣蛋白沉著和磷酸化人樣tau蛋白過表達。 總結(jié)與結(jié)論：匹羅卡品誘導(dǎo)CD1小鼠產(chǎn)生慢性復(fù)發(fā)性顳葉癲癇行為學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)改變。海馬和其它顳葉區(qū)域出現(xiàn)局部BACE1表達上調(diào),定位于異常芽生軸突末梢。在BACE1上調(diào)的同一區(qū)域,存在樹突成分損傷或丟失。在缺乏人為(病理／態(tài)基因)誘導(dǎo)可能產(chǎn)生腦可溶性Aβ高水平的前提下,顳葉癲癇腦內(nèi)發(fā)生過度生成Ap的神經(jīng)元調(diào)控變化；盡管在成年CD1小鼠,實驗性癲癇未引起典型腦淀粉樣斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)病變。 第二部分轉(zhuǎn)基因3X Tg-AD小鼠AD樣神經(jīng)病理發(fā)生與演化 實驗原理與目的：轉(zhuǎn)基因3×Tg-AD小鼠隨年齡發(fā)育而出現(xiàn)腦組織細胞外淀粉樣斑和神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過磷酸化病變。本實驗將對課題組繁殖的3×Tg-AD小鼠淀粉樣斑和tau病變的年齡和腦區(qū)域相關(guān)性演化進行評估。此外,尚無研究報道3×Tg-AD小鼠腦內(nèi)是否存在BACE1表達異常。本實驗也旨在明確BACE1與3X Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑病變的相關(guān)性。 材料與方法：采用雄性3X Tg-AD及非轉(zhuǎn)基因小鼠,1-26月齡。腦組織行生化和免疫組化分析。各月齡組腦鄰片進行BACE1, Aβ和磷酸化tau (p-tau)染色。特定年齡組腦切片行熒光雙標(1)BACE1與Aβ、p-tau,(2)N-端,中段或C-端特異性Aβ抗體交互雙標,(3)BACE1與特異神經(jīng)元標記物。免疫印跡法檢測BACE1和其直接產(chǎn)物淀粉樣蛋白前體(APP)貝塔位點剪切片段(p-CTF)水平,酶試劑盒檢測BACE1酶活性。 結(jié)果：(1)3×Tg-AD小鼠前腦內(nèi)12-14月齡開始出現(xiàn)Aβ染色陽性淀粉樣斑,始見于海馬下托,隨年齡擴展至海馬與皮質(zhì)各層,可見致密型斑,但多為彌散型。BACE1陽性失營養(yǎng)性突起的出現(xiàn)和擴展呈現(xiàn)上述相同時空演化過程。(2)AβN-端(3D6,6E10)和中段(4G8,E50)特異抗體顯示皮質(zhì)和海馬錐體神經(jīng)元胞體,2月齡即出現(xiàn)。經(jīng)強蟻酸切片預(yù)處理,還標記腫脹樣軸突末梢,4-6月齡開始出現(xiàn)。這些軸突末梢可被BACE1及β-CTF抗體熒光共標記。(3)AβC-端特異抗體僅顯示胞外淀粉樣蛋白沉著。(4)磷酸化tau蛋白反應(yīng)產(chǎn)物存在于部分皮質(zhì)和海馬錐體神經(jīng)元胞體和樹突,2月齡即出現(xiàn),隨年齡增加而增強。(5)與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比,3×Tg-AD小鼠腦BACEK β-CTF、BACE1酶活性水平從12—14月齡開始增加,18—22月齡達到統(tǒng)計學(xué)意義。 總結(jié)與結(jié)論：3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣和tau病變表現(xiàn)年齡和區(qū)域相關(guān)性發(fā)生和進展過程,但兩者之間無明顯相關(guān)性。腦淀粉蛋白沉積可表現(xiàn)為致密型和彌散型,兩者的發(fā)生可能均與先期出現(xiàn)的軸突病變有關(guān)。早期軸突病變表現(xiàn)為腫脹和芽生,伴隨BACE1和一些Aβ抗體染色陽性染色,后者可能代表APP β-CTF聚集。BACE1上調(diào)在3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑的起始和演化過程中扮演關(guān)鍵作用。 第三部分癲癇3×Tg-AD小鼠AD樣神經(jīng)病理發(fā)生與變化 實驗原理與目的：我們在第一部分實驗發(fā)現(xiàn)腦BACE1上調(diào)伴隨癲癇CD1小鼠邊緣系統(tǒng)病理性軸突芽生。第二部分實驗證實BACE1上調(diào)定位于早期腫脹軸突末梢和失營養(yǎng)性神經(jīng)突起,并伴隨3×Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑發(fā)生過程。本部分研究從實驗病理學(xué)角度探討皮羅卡品癲癇是否提前和促進3X Tg-AD小鼠腦淀粉樣斑和tau病變。本實驗旨在檢測癲癇腦內(nèi)進行性軸突病變因伴隨BACE1上調(diào)會腦區(qū)域特異性的引起淀粉樣斑形成,也可能與tau蛋白過度磷酸化相關(guān)。通過這些觀察,試圖闡述顳葉癲癇表現(xiàn)AD樣神經(jīng)病變的病理發(fā)生機制。 材料與方法：采用6-8月齡雄性3X Tg-AD小鼠,皮羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)急性痙攣性驚厥,對照組腹腔注射生理鹽水。錄像監(jiān)控證實皮羅卡品組動物出現(xiàn)發(fā)作性、痙攣性驚厥。動物存活至9、11和14月齡(n=4/年齡組),行腦組織學(xué)與免疫組織化學(xué)檢測,對海馬和邊緣系統(tǒng)區(qū)域的細胞構(gòu)筑、BACE1、APP、Aβ、p-tau和神經(jīng)元特異核抗原(NeuN)免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物進行定性定量分析。 結(jié)果：(1)與對照組相反,癲癇3X Tg-AD小鼠呈現(xiàn)典型海馬苔蘚纖維芽生,表現(xiàn)為齒狀回分子層內(nèi)份出現(xiàn)BACE1強染色帶。(2)在9和11月齡癲癇小鼠,海馬、梨狀皮質(zhì)和杏仁核出現(xiàn)BACE1陽性失營養(yǎng)性神經(jīng)突起簇、而對照組無或罕見此類結(jié)構(gòu)。在14月齡癲癇小鼠,這些失營養(yǎng)性神經(jīng)突起簇的數(shù)目多于對照組,且分布比對照組廣泛。(3)雙重標記分析表明BACE1日性失營養(yǎng)性神經(jīng)突起為軸突成分,且伴隨局灶性細胞外Ap沉積。(4)定量分析表明癲癇小鼠海馬CA1和下托區(qū)失營養(yǎng)性神經(jīng)突起簇和淀粉樣斑光密度均高于對照組。(5)與對照組相比,9、11和14月齡癲癇小鼠齒狀回分子層、顆粒細胞層和苔蘚纖維終末p-tau染色增強,而在CA1區(qū)p-tau產(chǎn)物減少。(6)9、11和14月齡癲癇小鼠CA1、CA3區(qū)和梨狀皮質(zhì)出現(xiàn)細胞丟失和NeuN免疫反應(yīng)下降。 總結(jié)與結(jié)論：和對照轉(zhuǎn)基因動物相比,匹羅卡品誘導(dǎo)的慢性癲癇3×Tg-AD小鼠邊緣系統(tǒng)部分區(qū)域出現(xiàn)更早和更嚴重的淀粉樣斑病變和神經(jīng)元內(nèi)磷酸化tau表達。癲癇3X Tg-AD小鼠腦內(nèi)這兩種AD樣病變與神經(jīng)元損傷和死亡存在區(qū)域性相關(guān)。BACE1過表達是慢性癲癇動物受損傷腦區(qū)軸突芽生及失營養(yǎng)性變的內(nèi)在信號分子變化之一,可能是加快淀粉斑病變關(guān)鍵因素。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Synapse formation and remodeling[J];Science China(Life Sciences);2010年03期

2 POO Mu-Ming;;Progress in neural plasticity[J];Science China(Life Sciences);2010年03期

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本文編號：2264311