【摘要】：研究背景和目的 阿爾茲海默病(Alzheimer's disease, AD)是老年癡呆癥的最常見原因,在65歲以上的老年人中的發(fā)病率約為5%,而且年齡每增長5歲,其發(fā)病率即增高一倍。AD的特征性病理改變包括神經(jīng)纖維纏結(jié),其主要成分為不溶性的高磷酸化狀態(tài)tau蛋白,和老年斑,其主要成分為不溶性的Ap沉積物。研究發(fā)現(xiàn),AD患者大腦海馬區(qū)域神經(jīng)元高表達Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase1A (DYRK1A)。DYRK1A是果蠅Minibrain kinase (MNB)的人類同源體,在生長、發(fā)育及胚后期神經(jīng)生成的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。多項研究表明,DYRK1A的高表達盡管并不是造成AD神經(jīng)病理學(xué)改變的充分條件,卻是必不可少的因素,其參與了APP的過度磷酸化、tau蛋白的形成,亦參與了APP的酶解過程,促進細胞內(nèi)Aβ的生成。此外,DYRK1A通過磷酸化含有RPX(S/T)P共同氨基酸序列的底物,參與多種病理生理過程。由于DYRK1A具有基因劑量效應(yīng),研究DYRK1A在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)具有重要意義。 神經(jīng)元限制性沉默因子,RE-1silencer of transcription factor (REST; also known as neuron-restrictive silencing factor, NRSF)通過與神經(jīng)元限制性元件(neuron-restrictive silencer element, NRSE)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)神經(jīng)元性基因的表達。REST/NRSF主要在神經(jīng)前體細胞和非神經(jīng)細胞中表達。但近年來的研究表明,在中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤其是海馬,存在REST/NRSF的高表達。DYRK1A和REST/NRSF在海馬的共同表達為我們研究REST與DYRK1A的相互作用提供了理論依據(jù)。 目前,國內(nèi)外關(guān)于DYRK1A在AD發(fā)病機制中的研究方興未艾,其中涉及最多的是DYRK1A的磷酸化作用對tau蛋白及Ap生成的影響。已有研究表明,DYRK1A劑量的升高或降低均造成REST mRNA含量的降低,而對于DYRK1A劑量對REST蛋白的影響及可能作用機制卻無相關(guān)研究。關(guān)于DYRK1A轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的研究僅有2篇文獻,但并沒有轉(zhuǎn)錄因子REST對DYRK1A轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面的研究。由于DYRK1A具有基因劑量效應(yīng),過量和低表達的DYRK1A對機體都有不利影響。 本課題通過研究DYRK1A與REST蛋白的相互作用,進一步認識二者在AD病理生理機制中的重要作用,以期望能發(fā)展新的治療方法。 材料和方法 1.細胞培養(yǎng)：共培養(yǎng)了HEK293、C6、PC12、N2a四種細胞,用作后續(xù)試驗。 2. REST對人類DYRK1A基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控：通過PCR從人類基因組得到DYRK1A全啟動子區(qū)域并利用合適的酶切位點,將其連入不含有啟動子的pGL3-Basic載體中；在HEK293細胞中無或有REST存在的情況下,觀察該啟動子的活性變化；使用RNAi技術(shù),將HEK293細胞內(nèi)源性REST敲除后,提取細胞總RNA,使用半定量RT-PCR技術(shù),觀察HEK293細胞中REST高表達與敲除時DYRK1A mRNA的變化,并使用一個公認的能被REST抑制的靶基因-BDNF基因,作為驗證基因；在HEK293細胞中高表達REST48小時后,提取細胞總RNA,用Taqman實時熒光定量RT-PCR檢測DYRK1A mRNA表達水平,并在鼠源性C6和N2a細胞中使用半定量的方法進行驗證；將該啟動子與DYRK1A的表達載體與RNAi在N2a細胞中共表達,觀察DYRK1A對自身劑量變化的反應(yīng)。 3. DYRK1A基因啟動子區(qū)的功能性NRSE位點的確定：在線啟動子軟件分析顯示DYRK1A啟動子區(qū)域含有3個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子REST結(jié)合元件-NRSE。構(gòu)建含有人類DYRK1A基因不同啟動子區(qū)域的載體,將其分別轉(zhuǎn)染入表達REST的C6細胞和基本不表達REST的PC12細胞中,采用雙熒光報告系統(tǒng)檢測由于REST表達量的差別而造成的其在這兩種不同細胞系中的啟動子活性變化趨勢,尋找轉(zhuǎn)錄因子REST對DYRK1A基因可能的調(diào)控位點,并在PC12細胞系中共轉(zhuǎn)REST表達載體與各個啟動子片段,驗證這種變化趨勢；采用凝膠遷移率試驗(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)實驗分別從體外和體內(nèi)兩種途徑驗證雙上述實驗找到的功能性NRSE位點。 4.檢測DYRK1A與REST在C57BL/6小鼠大腦發(fā)育過程中及在不同細胞系中的表達情況：使用免疫熒光技術(shù)檢測DYRK1A與REST蛋白在正常成年小鼠海馬和大腦皮層的表達情況；取胚胎(embryonic)E13、E17及生后(postnatal)P1、P7、P14、P30小鼠的大腦,提取組織總RNA,采用實時定量熒光PCR技術(shù)檢測用Dyrk1a與Rest mRNA的含量；提取培養(yǎng)的PC12、 C6、N2a細胞總RNA,使用半定量RT-PCR技術(shù),檢測Dyrk1a與Rest mRNA在不同細胞系的表達情況。 5.在鼠源性細胞系中檢測DYRK1A蛋白的表達升高與敲除對轉(zhuǎn)錄因子REST表達的影響及其作用機制：構(gòu)建DYRK1A的小干擾RNA (siRNA)并在N2a和HEK293中驗證其干擾作用；將DYRK1A的表達載體及siRNA分別轉(zhuǎn)染入N2a細胞,48小時后提取細胞總RNA,并采用半定量RT-PCR方法檢測內(nèi)源性Rest mRNA的表達變化；將DYRK1A的表達載體及siRNA與REST表達載體共轉(zhuǎn),western blotting檢測REST蛋白的表達變化,并使用蛋白合成抑制劑cycloheximide (CHX)處理,觀察蛋白降解速度,以確定DYRK1A劑量變化對REST蛋白造成的影響與REST蛋白的降解之間的關(guān)系；由于REST蛋白的降解與其C末端的泛素化有關(guān),我們將泛素表達載體、REST表達載體和DYRK1A的表達或干擾載體共轉(zhuǎn)入HEK293細胞中,用泛素抗體(Ubi)作為免疫沉淀的抗體,用REST抗體做western檢測,觀察DYRK1A高或低表達對REST泛素化程度的影響,并構(gòu)建了不含有C末端的REST表達載體,與DYRK1A的表達或干擾載體共轉(zhuǎn)入HEK293細胞驗證這種影響。 6.檢測REST轉(zhuǎn)錄活性是否受到DYRK1A劑量的影響：我們使用公認的可以被轉(zhuǎn)錄因子REST下調(diào)的靶基因-BDNF來反映REST的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)在N2a細胞中轉(zhuǎn)染DYRK1A的表達載體和干擾siRNA時,我們分別從mRNA和啟動子活性水平觀測BDNF基因受到的影響；并在無和有外源性REST蛋白存在的情況下,提取受到DYRK1A的高表達和干擾處理的N2a細胞核提取物,采用使用凝膠遷移率試驗(Electrophoretic mobility shift assay, EMS A)觀測REST蛋白與其靶序列的結(jié)合能力變化。 結(jié)果 1.REST可以激活人類DYRK1A基因的轉(zhuǎn)錄：將PCR得到的人類DYRK1A基因啟動子區(qū)域連入pGL3-Basic載體后并轉(zhuǎn)染入HEK293細胞,發(fā)現(xiàn)此啟動子有較高的活性;將REST表達載體與此啟動子共轉(zhuǎn),發(fā)現(xiàn)REST高表達可使其活性顯著增高；相對于BDNF mRNA在REST高表達時的降低,半定量RT-PCR結(jié)果表明REST高表達可以明顯升高人類DYRK1A基因mRNA水平,而REST的敲除則導(dǎo)致DYRK1A mRNA的明顯降低,并在鼠源性的PC12和C6細胞系中得到進一步的驗證；實時定量PCR亦發(fā)現(xiàn)REST可明顯升高DYRK1A mRNA表達；DYRK1A基因的啟動子活性在DYRK1A高表達或干擾時均降低。 2.人類DYRK1A基因啟動子區(qū)的-833to-815bp可與REST結(jié)合,發(fā)揮功能性神經(jīng)限制性沉默元件(neuron restrictive silencing element, NRSE)的作用：人類DYRK1A基因啟動子區(qū)的3個預(yù)測NRSE位點分別是：-833到-815bp對應(yīng)第一個NRSE位點(NRSE-DY1),-644到-626bp對應(yīng)第二個NRSE位點(NRSE-DY2),-550到-534bp對應(yīng)第三個NRSE位點(NRSE-DY3)。雙熒光報告系統(tǒng)結(jié)果顯示,在BDNF基因上游包含NRSE位點的pBDNFluc在PC12細胞中的活性明顯高于C6細胞,含有DYRK1A啟動子區(qū)-833到-815bp的載體在C6中有更高的活性,而去掉-833to-815bp的啟動子片度載體在PC12和C6細胞中則沒有這種差異；共轉(zhuǎn)REST表達載體和DYRK1A啟動子載體的PC12細胞也顯示,REST表達可降低pBDNFluc的活性,升高含有-833到-815bp的DYRK1A啟動子載體的活性；凝膠遷移率試驗(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)實驗結(jié)果也顯示第一個NRSE預(yù)測位點(人類DYRK1A基因-833到-815bp)可以與REST結(jié)合,導(dǎo)致REST對DYRK1A基因的上調(diào)。 3. DYRK1A和REST共同表達在正常成年小鼠大腦、神經(jīng)發(fā)育過程和不同細胞系中：免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),DYRK1A和REST蛋白共同表達在正常成年小鼠的海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元；實時定量熒光PCR發(fā)現(xiàn)Dyrk1a和Rest mRNA在E13、E17、P1、P7、1P14、P30小鼠大腦中的表達變化趨勢亦一致,均在P7至P14處于較高水平,而在P30表達水平下降,但仍然可以檢測的到；Dyrk1a mRNA在含Rest mRNA較高的C6和N2a細胞系中表達較高,而在Rest mRNA含量非常低的PC12細胞系中幾乎檢測不到。 4. DYRK1A的表達升高與敲除均可以下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子REST的表達水平：構(gòu)建針對鼠源性Dyrk1a的小干擾RNA (psi-DY)并在N2a細胞中驗證其干擾效果；當(dāng)把DYRK1A的表達載體及psi-DY分別轉(zhuǎn)染入N2a細胞,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性Rest mRNA均顯著降低；將DYRK1A的表達載體及psi-DY與REST表達載體共轉(zhuǎn),亦發(fā)現(xiàn)REST蛋白顯著降低,使用蛋白合成抑制劑cycloheximide (CHX)處理1小時或2小時后,共轉(zhuǎn)DYRK1A的表達載體及psi-DY的HEK293細胞內(nèi)蛋白降解速度加快；將泛素表達載體、REST表達載體和DYRK1A的表達或干擾載體共轉(zhuǎn)入HEK293細胞中,用泛素抗體(Ubi)作為免疫沉淀的抗體,用REST抗體做western檢測時發(fā)現(xiàn)DYRK1A高或低表達均可以增強REST蛋白的泛素化程度；而將缺少C末端的REST蛋白的突變形式-REST-FS與DYRK1A的表達或干擾載體共轉(zhuǎn)時,卻未發(fā)現(xiàn)REST蛋白的降低。 5. DYRK1A的表達升高與敲除均可以造成REST的轉(zhuǎn)錄活性的降低：把DYRK1A的表達載體及psi-DY分別轉(zhuǎn)染入N2a細胞,發(fā)現(xiàn)Bdnf mRNA水平升高,BDNF啟動子活性增強；從經(jīng)過單轉(zhuǎn)pDYRK1A, psi-DY,或空載體以及與REST表達載體共轉(zhuǎn)作用處理的N2a細胞中提取核提取物并進行EMSA檢測,發(fā)現(xiàn)REST蛋白與經(jīng)過pDYRK1A和psi-DY處理的核提取物結(jié)合能力顯著降低。 結(jié)論 1.轉(zhuǎn)錄因子REST可以激活人類DYRK1A基因的轉(zhuǎn)錄。 2.與DYRK1A啟動子區(qū)的-833to-815bp相對應(yīng)的第一個NRSE位點是REST可以上調(diào)DYRK1A基因的原因。 3. Dyrk1a和Rest共同表達在正常成年小鼠大腦、神經(jīng)發(fā)育過程以及PC12、C6和N2a細胞系中。 4.無論DYRKIA蛋白水平升高或降低,均可以下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子REST的表達。 5.無論DYRK1A蛋白水平升高或降低,均可以下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子REST的轉(zhuǎn)錄活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

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本文編號：2218029