【摘要】：阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease, AD)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚沒(méi)有定論,很多研究表明Aβ及其聚集體是AD發(fā)生發(fā)展的重要影響因素,因此研發(fā)能夠針對(duì)Aβ聚集體的抑制劑或藥物成為越來(lái)越受到關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。在基于抗Aβ抗體治療AD的方法中,目前多采用人源化多克隆或單克隆抗體和小分子單鏈抗體等,與之相比,納米抗體由于制備成本低、容易跨越血腦屏障等優(yōu)點(diǎn),在抗體療法中受到越來(lái)越多的研究和關(guān)注。另外,已有的研究表明,Aβ的氮端不參與Aβ的聚集,用于臨床實(shí)驗(yàn)的能夠識(shí)別Aβ氮端的抗體因?yàn)槟芤饳C(jī)體更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)而不得不停止臨床實(shí)驗(yàn)；而Aβ中間片段是與Aβ聚集相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)以及毒性片段,極易形成β折疊結(jié)構(gòu),而β折疊正是Aβ聚集體主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),能夠識(shí)別Aβ聚集區(qū)段的抗體的炎癥反應(yīng)相對(duì)較低,因此,篩選能夠特異性結(jié)合Aβ中間段的納米抗體對(duì)于抑制Aβ的聚集和探索Aβ聚集機(jī)制將具有重要意義。本論文選擇Aβ肽全長(zhǎng)的中間段Aβ12-35作為抗原,篩選其納米抗體,并通過(guò)E.coli表達(dá)系統(tǒng)制備納米抗體,并探討了其對(duì)Aβ聚集能力的影響。本論文研究?jī)?nèi)容如下：(1)納米抗體基因序列的篩選。以Aβ12-35單體作為抗原,通過(guò)抗原的定點(diǎn)固載,利用噬菌體展示庫(kù)技術(shù),經(jīng)過(guò)4輪淘選,ELISA測(cè)定親和活性,從Aβ42噬菌體免疫庫(kù)中篩選得到DP4、DP6、DP18和DP36四種納米抗體基因序列。(2)納米抗體的表達(dá)純化。通過(guò)PCR擴(kuò)增、雙酶切等方法將4種納米抗體基因克隆到表達(dá)載體pET23a;重組質(zhì)粒在宿主菌E.coli Shuffle T7和E.coli Origami 2(DE3)中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。純化后其純度均能達(dá)到90%以上。經(jīng)ELISA活性檢測(cè),S-DP4, O-DP4, S-DP6, O-DP6表現(xiàn)出較好的抗原結(jié)合活性。Biacore測(cè)定其親和常數(shù),S-DP6親和常數(shù)最高,約為10-7,其他三種親和常數(shù)在10-6,結(jié)果與ELISA基本相符。(3)納米抗體的功能研究。ELISA結(jié)果表明,納米抗體S-DP6除了能識(shí)別Aβ12-35單體和聚集體,還能識(shí)別Aβ40和Aβ42的單體和聚集體；體外利用ThT熒光法和電子顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),所獲得的納米抗體S-DP6對(duì)Aβ12-35單體的聚集和纖維化有抑制作用；對(duì)已形成的Aβ12-35纖維有解聚作用�？傊�,本論文篩選獲得的納米抗體對(duì)多種Aβ都有識(shí)別作用,且可以影響Aβ的聚集過(guò)程,為Aβ聚集引起的疾病機(jī)理的研究提供了很好的研究材料。
[Abstract]:Alzheimer's disease (Alzheimer's disease, AD) is a severe neurodegenerative disease, and its pathogenesis is still unknown. Many studies have shown that A 尾 and its aggregates are important factors influencing the development of AD. Therefore, the development of A-尾-agglomerate inhibitors or drugs has become one of the hot research topics. In the treatment of AD based on anti-A 尾 antibody, humanized polyclonal or monoclonal antibodies and small molecular single chain antibodies are used. Compared with these methods, nano-antibody can easily cross the blood-brain barrier because of its low preparation cost. More and more attention has been paid to antibody therapy. In addition, previous studies have shown that the nitrogen terminal of A 尾 does not participate in the aggregation of A 尾, and the antibody which can recognize the nitrogen terminal of A 尾 in clinical trials has to stop clinical trials because it can cause a stronger inflammatory reaction in the body. The A 尾 intermediate fragment is the key site associated with A 尾 aggregation and the toxic fragment. It is easy to form a 尾 folding structure, and 尾 folding is the main structural feature of A 尾 aggregation, and the inflammatory response to the antibody in A 尾 accumulation region is relatively low. Therefore, it is important to screen nano-antibodies that can specifically bind to the middle of A 尾 in order to inhibit the aggregation of A 尾 and to explore the mechanism of A 尾 aggregation. In this paper, A 尾 12-35, the intermediate part of A 尾 peptide, was selected as the antigen to screen its nanometer antibody, and the nanometer antibody was prepared by E. coli expression system, and the effect on the aggregation ability of A 尾 was discussed. The main contents of this thesis are as follows: (1) screening of nano-antibody gene sequence. Using A 尾 12-35 monomer as antigen, the affinity activity was determined by using phage display library technique and four rounds of Amoy Elisa. (2) the expression and purification of dp4, dp6, DP18 and DP36 were obtained from the A 尾 42 phage library. (2) the expression and purification of the antibody. By PCR amplification and double enzyme digestion, four kinds of nano-antibody genes were cloned into the expression vector pET23a.The recombinant plasmid was expressed in E. coli Shuffle T7 and E. coli Origami 2 (DE3). After purification, the purity was above 90%. S-DP4, O-DP4, S-DP6, O-DP6 showed good antigen-binding activity. Biacore showed that the affinity constant of S-DP6 was the highest, about 10-7, and the other three affinity constants were 10-6. The antibody S-DP6 can recognize not only A 尾 12-35 monomer and aggregates, but also A 尾 40 and A 尾 42 monomers and aggregates. The obtained nano-antibody S-DP6 can inhibit the aggregation and fibrosis of A 尾 12-35 monomer and depolymerize the formed A 尾 12-35 fiber. In conclusion, the nanometer antibodies obtained in this paper can recognize many kinds of A 尾, and can affect the aggregation process of A 尾, which provides a good material for the study of the disease mechanism caused by A 尾 aggregation.
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2130389