本文選題：淀粉樣蛋白前體 + 亞片段��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：研究目的：目前AD的疫苗研制大多都是以Aβ為靶點進行的。但通過內(nèi)吞作用沉積于細胞內(nèi)的Aβ同樣會影響AD的發(fā)生發(fā)展�？纱蠖鄶�(shù)抗體不能進入細胞內(nèi),故對此顯得束手無策。因此從源頭減少Aβ的產(chǎn)生就顯得尤為重要。本實驗探索APP β剪切位點上游區(qū)域,欲從中尋找出對Aβ生成起到調(diào)控作用的結(jié)構(gòu),從而為尋找新的治療靶位及下一步新型疫苗的研發(fā)打下基礎(chǔ)。 實驗方法：構(gòu)建加載有APPsw695亞片段基因與GFP融合基因的pcdna3.1+真核細胞載體,其中亞片段基因包括APP1-695、APP265-695、APP507-695及APP590-695等多核苷酸鏈。構(gòu)建后經(jīng)通過測序,符合預(yù)期要求。將重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞中,作為實驗組。以未轉(zhuǎn)染的HEK-293T細胞作為對照組。轉(zhuǎn)染36小時后通過WB(Western blot)方法對Aβ產(chǎn)量進行半定量分析及MTT法的對細胞活性進行檢測。所得計量數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P0.05表示有顯著性差異。 實驗結(jié)果： 1.經(jīng)優(yōu)化設(shè)計后的片段于大腸桿菌中擴增量較高且對宿主增殖無明顯影響,經(jīng)測序證實符合預(yù)期要求。 2.轉(zhuǎn)染后分別于24h、36h、48h于倒置顯微鏡下對細胞形態(tài)進行觀測,發(fā)現(xiàn)貼壁率逐漸下降,且各培養(yǎng)基顏色未見變化提示無消耗產(chǎn)酸跡象。至60h左右,各組細胞完全脫壁,聚集成團懸浮于培養(yǎng)液中。 3.對各組細胞轉(zhuǎn)染36h后上清液中Aβ進行檢測,于4.5KD位置無明顯條帶顯影。結(jié)論： 1.將突變基因點對應(yīng)基因(APPsw695:K595N、M596L)優(yōu)化為符合細菌宿主的AATCTG與AACCTG,有助于細菌的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒的擴增。 2.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在對HEK-293T細胞進行APPSW1-695轉(zhuǎn)染過程中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后細胞存活率逐漸下降直至死亡,提示此種細胞可能不適用于AD模型的制造。接觸性抑制弱的細胞可能成為AD模型的首選。 3.雖然Aβ作為“瀑布級聯(lián)學(xué)說”的起始致病因素,但APP所造成細胞間的相互交聯(lián),可能也對細胞的活性也產(chǎn)生負性影響,其在發(fā)病過程中的作用較以往認識更為重要。 4.WB技術(shù)在對小分子蛋白的檢測中仍表現(xiàn)欠佳,因此目前研究Aβ應(yīng)避免采取此種方法進行檢測。 5.在體外Aβ可能進一步聚合成多聚體形式,從而造成WB的特異性一抗,對于此產(chǎn)物并不能識別,因此造成此次試驗的假陰性結(jié)果。進一步探索Aβ體外多聚體的形成及所需條件、時間及可能性,不僅可解決利用WB技術(shù)對Aβ體外檢測時條帶選擇及小分子不可分辨問題,可能也有助于腦內(nèi)老年斑形成時間窗的判定與干預(yù)。
[Abstract]:Objective: at present, most of AD vaccines are based on A 尾.But A 尾 deposited in cells through endocytosis also affected the development of AD.But most antibodies can not enter the cell, so this seems helpless.Therefore, it is particularly important to reduce the production of A 尾 from the source.The aim of this study was to explore the upstream region of the APP 尾 shear site, and to find out the structure that regulates the A 尾 production, thus laying a foundation for the development of new therapeutic targets and new vaccines.Methods: the eukaryotic vector of pcdna3.1 containing APPsw695 subfragment gene and GFP fusion gene was constructed. The subfragment genes included APP1-695, APP265-695, APP507-695 and APP590-695.After construction by sequencing, according with the expected requirements.Recombinant plasmids and empty plasmids were transfected into HEK-293T cells by liposome transfection.Untransfected HEK-293T cells were used as control group.After 36 hours of transfection, A 尾 production was semi-quantitatively analyzed by WB(Western blot method and the activity of cells was detected by MTT method.The measured data were tested by 蠂 ~ 2 test with SPSS17.0 software, and the test level was 0.05% (P < 0.05).Experimental results:1.The optimized fragment was amplified in Escherichia coli and had no obvious effect on host proliferation, which was confirmed by sequencing to meet the expected requirements.2.After transfection, the cell morphology was observed under inverted microscope at 24 h, 36 h and 48 h, respectively. It was found that the adherence rate decreased gradually, and no change in the color of the culture medium indicated that there was no sign of acid production.At about 60 h, the cells in each group were completely detached and clustered and suspended in the culture medium.3.After transfection for 36 h, A 尾 in the supernatant of each group was detected, and there were no obvious bands in the 4.5KD position.Conclusion:1.The mutated gene corresponding gene (APPsw695: K595NN M596L) was optimized to fit the bacterial host AATCTG and AACCTG, which was helpful to the transformation of bacteria and the amplification of plasmids.2.In the process of APPSW1-695 transfection of HEK-293T cells by liposome transfection, it was found that the survival rate of the cells decreased gradually until death after transfection, which suggested that the cells might not be suitable for the manufacture of AD model.The cells with weak contact inhibition may be the first choice of AD model.3.Although A 尾 is the initial pathogenetic factor of "cascade waterfall theory", the cross-linking of cells caused by APP may also have a negative effect on cell activity, and its role in pathogenesis is more important than previous understanding.The detection of small molecule protein by 4.WB is still poor, so we should avoid using this method to detect A 尾 at present.5.In vitro, A 尾 may be further polymerized to form a polymer, resulting in a specific antibody to WB, which can not be recognized for this product, thus resulting in false negative results of this test.Further exploring the conditions, time and possibility of formation, time and possibility of A 尾 in vitro Polymer can not only solve the problems of band selection and small molecule indiscernibility when using WB technology to detect A 尾 in vitro.It may also contribute to the determination and intervention of time window formation of senile plaques in the brain.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

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本文編號：1733386