本文選題：CUL4基因　切入點：精神發(fā)育遲滯　出處：《山東大學》2013年博士論文

【摘要】：2007年英國研究小組和本實驗室分別采用X染色體基因測序和候選基因定位克隆方法,發(fā)現(xiàn)人類CUL4B基因突變導致X連鎖精神發(fā)育遲滯(X linked mental retardation, XLMR)綜合征,患者除表現(xiàn)為精神發(fā)育遲滯外,還表現(xiàn)出身材矮小、步態(tài)異常、共濟失調(diào)、失語、癲癇、震顫和向心性肥胖等癥狀。之后各國學者又陸續(xù)在多個X連鎖精神發(fā)育遲滯家系檢測到CUL4B基因突變,目前已經(jīng)在12個X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征家系中發(fā)現(xiàn)了CUL4B基因突變,這使CUL4B基因成為繼FMR1、ATRX基因之后,最常見的X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征致病基因。CUL4B屬于cullin家族,該家族成員做為骨架蛋白參與構(gòu)成CULLIN-RING連接酶復合物(CRLs)。CRLs是目前已知的最大一類E3泛素連接酶,該復合物識別并降解特異性的底物,參與調(diào)控許多重要的生命活動,如細胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、細胞信號傳導和生物體發(fā)育等。目前研究發(fā)現(xiàn)cullin蛋白家族包括8個成員：CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、 CUL7和PARC,其中CUL4A和CUL4B同源性最高,蛋白同源性高達83%,在低等生物中僅存在Cul4一種同源蛋白。人類CUL4B基因突變導致精神發(fā)育遲滯綜合征,Cul4a基因敲除小鼠僅表現(xiàn)出精子發(fā)育異常,這說明在個體發(fā)育尤其是腦發(fā)育過程中CUL4A不能代償CUL4B的功能。目前發(fā)現(xiàn)的CRL4B的特異性的底物有：ERα、cyclin E、TopoI、PrxⅢ、 WDR5、TSC2、Jab1/CSN5、β-catenin等,這些底物在細胞周期、細胞分化、腫瘤發(fā)生以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。為研究CUL4B在精神發(fā)育遲滯綜合征發(fā)生中的作用機制,本研究在分析小鼠Cul4b基因表達的基礎上,采用條件性基因敲除方法建立Cul4b基因敲除小鼠模型,并對其進行了表型分析。本課題主要分為以下四部分：第一部分小鼠Cul4b表達模式分析做為分析小鼠Cul4b功能的第一步,我們首先以野生型C57BL/6J小鼠為研究對象,分析了Cul4b在小鼠多種組織尤其是腦組織中的時空表達特點、亞細胞定位以及表達的神經(jīng)細胞類型。1)采用Western blot和免疫組織化學的方法分析了Cul4b在小鼠胚胎期及成年期多種組織器官中的表達水平。Western blot結(jié)果顯示在胚胎期和成年期小鼠腦、脊髓、心、肝、脾、肺、腎和小腸等組織器官中都有Cul4b的表達。其中在胚胎期和成年期的腦組織中,Cul4b一直高表達。Cul4b在心臟中表達水平較低,成年期表達量很少,幾乎沒有。免疫組織化學的結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致。高倍鏡下我們發(fā)現(xiàn),Cul4b在腦、心、肝、脾、肺、腎和小腸等組織器官中主要亞細胞定位于細胞核。2)利用Western blot和免疫組織化學的方法分析了不同發(fā)育時期(E14.5、E17.5、P0、P14、P60等)小鼠腦組織中Cul4b的時空表達情況,重點分析了與學習記憶密切相關(guān)的皮層和海馬。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在胚胎期到成年期的小鼠大腦中,Cul4b一直高表達,特別是在皮層和海馬表達量非常高。與以往研究認為Cul4b在增殖細胞中高表達的研究結(jié)果不同,Cul4b在室管膜下區(qū)活躍增殖的神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞中表達水平很低,而主要在分裂后的成熟神經(jīng)細胞中表達。這一結(jié)果提示Cul4b在神經(jīng)系統(tǒng)中可能發(fā)揮著不同于在其他組織、細胞中的獨特作用。3)利用Cul4b與成熟神經(jīng)元標志物NeuN進行免疫熒光雙染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cul4b與絕大部分NeuN共定位,提示Cul4b主要在神經(jīng)元中表達。第二部分Cul4b條件性基因敲除小鼠模型的建立實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),攜帶CUL4B突變基因的細胞具有選擇劣勢,因此我們推測,很難通過經(jīng)典的基因敲除策略得到Cul4b缺陷的ES細胞。為此,本研究采用條件性基因敲除策略,先建立Cul4b基因打靶小鼠即Cul4b floxed小鼠。在得到Cul4b floxed小鼠后,通過與不同類型Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配后,獲得Cul4b條件性基因敲除小鼠。首先我們構(gòu)建了基因打靶載體,在Cul4b基因3-5外顯子的上、下游各引入一個loxP位點,同時為便于篩選還在內(nèi)含子5中插入了neo基因,載體上插入了TK基因。構(gòu)建好的載體經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)入129小鼠雄性ES細胞,經(jīng)過篩選后,利用Southern blot和長片段PCR方法對96個ES細胞克隆進行了分析,從中獲得了兩個正確重組的ES克隆。將這兩個正確重組的ES細胞注射入 C57BL/6J小鼠囊胚后獲得嵌合型小鼠,嵌合型小鼠與野生型小鼠交配后獲得Cul4b基因打靶小鼠,即Cul4b floxed小鼠。為驗證以上方法可以獲得Cul4b敲除小鼠,我們首先將Cul4b floxed、鼠與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,得到Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠。進而從敲除小鼠大腦提取蛋白和RNA進行分析。神經(jīng)組織特異性敲除小鼠腦組織Cul4b基因cDNA測序分析證實缺失外顯子3-5后,外顯子2和外顯子6相接,導致移碼突變,突變基因即使翻譯也只能產(chǎn)生28個氨基酸組成的短肽；實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)缺失外顯子3-5的Cul4b mRNA表現(xiàn)為無義突變介導的mRNA降解；Western blot結(jié)果證實在敲除小鼠的腦組織中幾乎檢測不到Cul4b蛋白。以上分析證實采用以上策略可以獲得Cul4b基因缺失小鼠。第三部分Cul4b全身性敲除小鼠的表型分析為研究Cul4b在發(fā)育中的作用,我們首先建立了Cul4b全身性敲除小鼠模型。1)將Cul4b floxed小鼠與ElIα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配可以建立Cul4b基因全身性敲除小鼠模型,但在新生小鼠中未檢測到敲除小鼠,提示敲除小鼠胚胎期致死。2)為明確Cul4b敲除小鼠胚胎致死時間,通過定時交配獲得了準確孕齡的各發(fā)育階段小鼠,發(fā)現(xiàn)在E7.5和E8.5可以獲得敲除小鼠,但在E9.5不能檢測到敲除小鼠,說明Cul4b基因敲除小鼠胚胎在8.5至9.5天之間死亡。HE染色發(fā)現(xiàn)Cul4b敲除小鼠E7.5天胚胎明顯小于野生對照,而且胚胎組織結(jié)構(gòu)紊亂。3)為明確Cul4b敲除小鼠胚胎致死原因,我們對小鼠胚胎細胞增殖和凋亡情況進行了分析,發(fā)現(xiàn)Cul4b敲除小鼠胚胎細胞增殖明顯減少,而細胞凋亡則明顯增加；同時我們也發(fā)現(xiàn)Cul4b敲除導致cyclin E的累積,與體外研究結(jié)果一致。4) Cul4b基因敲除雜合子小鼠出生數(shù)量也明顯低于預期,且新生的雜合子小鼠相對于同窩對照小鼠發(fā)育明顯遲滯。但是隨著出生后發(fā)育,Cul4b基因雜合子小鼠的發(fā)育水平能逐漸趕上對照小鼠。進一步分析發(fā)現(xiàn),雜合子小鼠的胎盤發(fā)育異�？赡苁菍е码s合子小鼠子宮內(nèi)發(fā)育遲緩的原因。第四部分Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的表型分析由于Cul4b基因全身性敲除小鼠胚胎期致死,無法獲得基因敲除小鼠用于神經(jīng)發(fā)育分析。為此,我們將Cul4b floxed小鼠與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,得到Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠。1)神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的敲除效率已在第二部分研究中經(jīng)大腦組織cDNA測序、實時定量PCR和Western blot等方法得到驗證。我們利用免疫熒光染色方法分析了培養(yǎng)的小鼠皮層原代神經(jīng)元,未檢測到Cul4b表達,進一步驗證了利用上述交配策略可以得到Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠,即Cul4bNestin-Cre小鼠。2)我們對Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠進行了長期觀察(2年),并未發(fā)現(xiàn)敲除小鼠存在明顯發(fā)育異常。利用Morris水迷宮,曠場試驗以及高架十字迷宮分析了Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的行為學變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠學習和記憶能力下降。這與人類CUL4B基因突變導致智力低下表型一致。Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠是研究精神發(fā)育遲滯的良好模型。3)利用HE染色分析了不同發(fā)育時期(E17.5, PO, P14, P60) Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠和同窩對照小鼠的腦組織切片,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠腦組織結(jié)構(gòu)上無明顯異常。4)Ki67免疫組織熒光顯示Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠細胞增殖無明顯異常,TUNEL結(jié)果顯示,Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠細胞凋亡也無明顯變化,Birthdating實驗結(jié)果顯示,Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠神經(jīng)細胞遷移與正常對照無明顯差異。5)因為Cul4b主要表達于分裂后的成熟神經(jīng)元,我們對新生小鼠和成年小鼠的腦切片進行了神經(jīng)元標志物NeuN的免疫組化檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠NeuN的表達與對照小鼠相比無明顯差異。6)對培養(yǎng)的E17.5皮層原代神經(jīng)元細胞進行免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠Map2(神經(jīng)元樹突標志物)和Tau(神經(jīng)元軸突標志物)表達情況與對照小鼠無明顯改變,提示在腦中敲除Cul4b并不影響樹突和軸突的大體結(jié)構(gòu)。7)利用Western blot分析了已報道的CRL4B復合物底物蛋白cyclin E, WDR5,和(3-catenin等在敲除小鼠中的表達情況,未檢測到異常表達。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)Cul4b在小鼠胚胎期和成年期的多種組織中廣泛表達,亞細胞定位于細胞核,其中在腦中表達最高,而且主要在分裂后成熟神經(jīng)元中表達。利用條件性敲除策略,我們成功獲得了Cul4b全身性敲除小鼠和神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠。Cul4b全身性敲除小鼠胚胎發(fā)育至8.5天左右死亡,對E7.5天胚胎分析發(fā)現(xiàn),Cul4b敲除小鼠胚胎細胞增殖明顯降低、而細胞凋亡明顯增加,同時有cyclin E的累積。Cul4b基因敲除雜合子小鼠出現(xiàn)子宮內(nèi)發(fā)育遲緩,其原因可能是胎盤發(fā)育異常所致。Cul4b基因神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠發(fā)育大體正常,組織學分析也未發(fā)現(xiàn)明顯異常,但行為學分析發(fā)現(xiàn),Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的學習和記憶能力下降,與人類CUL4B基因突變導致智力低下的臨床表型一致。因此,Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠是研究精神發(fā)育遲滯的良好模型,有助于研究精神發(fā)育遲滯發(fā)生的分子機制和發(fā)現(xiàn)治療靶點。
[Abstract]:CUL4A , CUL2 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL7 and PARC . The expression of Cul4b in brain , spinal cord , heart , liver , spleen , lung , kidney and small intestine was analyzed by Western blot and immunohistochemistry . In order to obtain Cul4b knockout mice , we constructed a gene targeting vector . After mating with different types of transgenic mice , we obtained two recombinant ES clones .
The mRNA expression of Cul4b mRNA deleted from exon 3 - 5 was found to be a nonsense mutation - mediated mRNA degradation by real - time quantitative PCR analysis .
Cul4b knockout mice were obtained by mating the Cul4b florescent mouse with ElI . alpha . - cre transgenic mice .
In this paper , we found that Cul4b gene knockout mice were able to knock out mice with specific knockout mice . The results showed that Cul4b gene knockout mice were able to knock out mice with specific knockout mice . Cul4b knockout mice developed a good model of mental retardation , which could help to study the molecular mechanism of mental retardation and the discovery of therapeutic targets .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749;R-332

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7 王s，

本文編號：1728005