本文選題：CUL4基因　切入點(diǎn)：精神發(fā)育遲滯　出處：《山東大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：2007年英國研究小組和本實(shí)驗(yàn)室分別采用X染色體基因測(cè)序和候選基因定位克隆方法,發(fā)現(xiàn)人類CUL4B基因突變導(dǎo)致X連鎖精神發(fā)育遲滯(X linked mental retardation, XLMR)綜合征,患者除表現(xiàn)為精神發(fā)育遲滯外,還表現(xiàn)出身材矮小、步態(tài)異常、共濟(jì)失調(diào)、失語、癲癇、震顫和向心性肥胖等癥狀。之后各國學(xué)者又陸續(xù)在多個(gè)X連鎖精神發(fā)育遲滯家系檢測(cè)到CUL4B基因突變,目前已經(jīng)在12個(gè)X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征家系中發(fā)現(xiàn)了CUL4B基因突變,這使CUL4B基因成為繼FMR1、ATRX基因之后,最常見的X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征致病基因。CUL4B屬于cullin家族,該家族成員做為骨架蛋白參與構(gòu)成CULLIN-RING連接酶復(fù)合物(CRLs)。CRLs是目前已知的最大一類E3泛素連接酶,該復(fù)合物識(shí)別并降解特異性的底物,參與調(diào)控許多重要的生命活動(dòng),如細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和生物體發(fā)育等。目前研究發(fā)現(xiàn)cullin蛋白家族包括8個(gè)成員：CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、 CUL7和PARC,其中CUL4A和CUL4B同源性最高,蛋白同源性高達(dá)83%,在低等生物中僅存在Cul4一種同源蛋白。人類CUL4B基因突變導(dǎo)致精神發(fā)育遲滯綜合征,Cul4a基因敲除小鼠僅表現(xiàn)出精子發(fā)育異常,這說明在個(gè)體發(fā)育尤其是腦發(fā)育過程中CUL4A不能代償CUL4B的功能。目前發(fā)現(xiàn)的CRL4B的特異性的底物有：ERα、cyclin E、TopoI、PrxⅢ、 WDR5、TSC2、Jab1/CSN5、β-catenin等,這些底物在細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。為研究CUL4B在精神發(fā)育遲滯綜合征發(fā)生中的作用機(jī)制,本研究在分析小鼠Cul4b基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,采用條件性基因敲除方法建立Cul4b基因敲除小鼠模型,并對(duì)其進(jìn)行了表型分析。本課題主要分為以下四部分：第一部分小鼠Cul4b表達(dá)模式分析做為分析小鼠Cul4b功能的第一步,我們首先以野生型C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象,分析了Cul4b在小鼠多種組織尤其是腦組織中的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)、亞細(xì)胞定位以及表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞類型。1)采用Western blot和免疫組織化學(xué)的方法分析了Cul4b在小鼠胚胎期及成年期多種組織器官中的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示在胚胎期和成年期小鼠腦、脊髓、心、肝、脾、肺、腎和小腸等組織器官中都有Cul4b的表達(dá)。其中在胚胎期和成年期的腦組織中,Cul4b一直高表達(dá)。Cul4b在心臟中表達(dá)水平較低,成年期表達(dá)量很少,幾乎沒有。免疫組織化學(xué)的結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致。高倍鏡下我們發(fā)現(xiàn),Cul4b在腦、心、肝、脾、肺、腎和小腸等組織器官中主要亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。2)利用Western blot和免疫組織化學(xué)的方法分析了不同發(fā)育時(shí)期(E14.5、E17.5、P0、P14、P60等)小鼠腦組織中Cul4b的時(shí)空表達(dá)情況,重點(diǎn)分析了與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的皮層和海馬。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在胚胎期到成年期的小鼠大腦中,Cul4b一直高表達(dá),特別是在皮層和海馬表達(dá)量非常高。與以往研究認(rèn)為Cul4b在增殖細(xì)胞中高表達(dá)的研究結(jié)果不同,Cul4b在室管膜下區(qū)活躍增殖的神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)水平很低,而主要在分裂后的成熟神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。這一結(jié)果提示Cul4b在神經(jīng)系統(tǒng)中可能發(fā)揮著不同于在其他組織、細(xì)胞中的獨(dú)特作用。3)利用Cul4b與成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN進(jìn)行免疫熒光雙染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cul4b與絕大部分NeuN共定位,提示Cul4b主要在神經(jīng)元中表達(dá)。第二部分Cul4b條件性基因敲除小鼠模型的建立實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),攜帶CUL4B突變基因的細(xì)胞具有選擇劣勢(shì),因此我們推測(cè),很難通過經(jīng)典的基因敲除策略得到Cul4b缺陷的ES細(xì)胞。為此,本研究采用條件性基因敲除策略,先建立Cul4b基因打靶小鼠即Cul4b floxed小鼠。在得到Cul4b floxed小鼠后,通過與不同類型Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配后,獲得Cul4b條件性基因敲除小鼠。首先我們構(gòu)建了基因打靶載體,在Cul4b基因3-5外顯子的上、下游各引入一個(gè)loxP位點(diǎn),同時(shí)為便于篩選還在內(nèi)含子5中插入了neo基因,載體上插入了TK基因。構(gòu)建好的載體經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)入129小鼠雄性ES細(xì)胞,經(jīng)過篩選后,利用Southern blot和長片段PCR方法對(duì)96個(gè)ES細(xì)胞克隆進(jìn)行了分析,從中獲得了兩個(gè)正確重組的ES克隆。將這兩個(gè)正確重組的ES細(xì)胞注射入 C57BL/6J小鼠囊胚后獲得嵌合型小鼠,嵌合型小鼠與野生型小鼠交配后獲得Cul4b基因打靶小鼠,即Cul4b floxed小鼠。為驗(yàn)證以上方法可以獲得Cul4b敲除小鼠,我們首先將Cul4b floxed、鼠與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,得到Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠。進(jìn)而從敲除小鼠大腦提取蛋白和RNA進(jìn)行分析。神經(jīng)組織特異性敲除小鼠腦組織Cul4b基因cDNA測(cè)序分析證實(shí)缺失外顯子3-5后,外顯子2和外顯子6相接,導(dǎo)致移碼突變,突變基因即使翻譯也只能產(chǎn)生28個(gè)氨基酸組成的短肽；實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)缺失外顯子3-5的Cul4b mRNA表現(xiàn)為無義突變介導(dǎo)的mRNA降解；Western blot結(jié)果證實(shí)在敲除小鼠的腦組織中幾乎檢測(cè)不到Cul4b蛋白。以上分析證實(shí)采用以上策略可以獲得Cul4b基因缺失小鼠。第三部分Cul4b全身性敲除小鼠的表型分析為研究Cul4b在發(fā)育中的作用,我們首先建立了Cul4b全身性敲除小鼠模型。1)將Cul4b floxed小鼠與ElIα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配可以建立Cul4b基因全身性敲除小鼠模型,但在新生小鼠中未檢測(cè)到敲除小鼠,提示敲除小鼠胚胎期致死。2)為明確Cul4b敲除小鼠胚胎致死時(shí)間,通過定時(shí)交配獲得了準(zhǔn)確孕齡的各發(fā)育階段小鼠,發(fā)現(xiàn)在E7.5和E8.5可以獲得敲除小鼠,但在E9.5不能檢測(cè)到敲除小鼠,說明Cul4b基因敲除小鼠胚胎在8.5至9.5天之間死亡。HE染色發(fā)現(xiàn)Cul4b敲除小鼠E7.5天胚胎明顯小于野生對(duì)照,而且胚胎組織結(jié)構(gòu)紊亂。3)為明確Cul4b敲除小鼠胚胎致死原因,我們對(duì)小鼠胚胎細(xì)胞增殖和凋亡情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)Cul4b敲除小鼠胚胎細(xì)胞增殖明顯減少,而細(xì)胞凋亡則明顯增加；同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)Cul4b敲除導(dǎo)致cyclin E的累積,與體外研究結(jié)果一致。4) Cul4b基因敲除雜合子小鼠出生數(shù)量也明顯低于預(yù)期,且新生的雜合子小鼠相對(duì)于同窩對(duì)照小鼠發(fā)育明顯遲滯。但是隨著出生后發(fā)育,Cul4b基因雜合子小鼠的發(fā)育水平能逐漸趕上對(duì)照小鼠。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),雜合子小鼠的胎盤發(fā)育異�？赡苁菍�(dǎo)致雜合子小鼠子宮內(nèi)發(fā)育遲緩的原因。第四部分Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的表型分析由于Cul4b基因全身性敲除小鼠胚胎期致死,無法獲得基因敲除小鼠用于神經(jīng)發(fā)育分析。為此,我們將Cul4b floxed小鼠與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,得到Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠。1)神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的敲除效率已在第二部分研究中經(jīng)大腦組織cDNA測(cè)序、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot等方法得到驗(yàn)證。我們利用免疫熒光染色方法分析了培養(yǎng)的小鼠皮層原代神經(jīng)元,未檢測(cè)到Cul4b表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了利用上述交配策略可以得到Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠,即Cul4bNestin-Cre小鼠。2)我們對(duì)Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠進(jìn)行了長期觀察(2年),并未發(fā)現(xiàn)敲除小鼠存在明顯發(fā)育異常。利用Morris水迷宮,曠場(chǎng)試驗(yàn)以及高架十字迷宮分析了Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的行為學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降。這與人類CUL4B基因突變導(dǎo)致智力低下表型一致。Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠是研究精神發(fā)育遲滯的良好模型。3)利用HE染色分析了不同發(fā)育時(shí)期(E17.5, PO, P14, P60) Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠和同窩對(duì)照小鼠的腦組織切片,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠腦組織結(jié)構(gòu)上無明顯異常。4)Ki67免疫組織熒光顯示Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠細(xì)胞增殖無明顯異常,TUNEL結(jié)果顯示,Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠細(xì)胞凋亡也無明顯變化,Birthdating實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠神經(jīng)細(xì)胞遷移與正常對(duì)照無明顯差異。5)因?yàn)镃ul4b主要表達(dá)于分裂后的成熟神經(jīng)元,我們對(duì)新生小鼠和成年小鼠的腦切片進(jìn)行了神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN的免疫組化檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠NeuN的表達(dá)與對(duì)照小鼠相比無明顯差異。6)對(duì)培養(yǎng)的E17.5皮層原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠Map2(神經(jīng)元樹突標(biāo)志物)和Tau(神經(jīng)元軸突標(biāo)志物)表達(dá)情況與對(duì)照小鼠無明顯改變,提示在腦中敲除Cul4b并不影響樹突和軸突的大體結(jié)構(gòu)。7)利用Western blot分析了已報(bào)道的CRL4B復(fù)合物底物蛋白cyclin E, WDR5,和(3-catenin等在敲除小鼠中的表達(dá)情況,未檢測(cè)到異常表達(dá)。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)Cul4b在小鼠胚胎期和成年期的多種組織中廣泛表達(dá),亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核,其中在腦中表達(dá)最高,而且主要在分裂后成熟神經(jīng)元中表達(dá)。利用條件性敲除策略,我們成功獲得了Cul4b全身性敲除小鼠和神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠。Cul4b全身性敲除小鼠胚胎發(fā)育至8.5天左右死亡,對(duì)E7.5天胚胎分析發(fā)現(xiàn),Cul4b敲除小鼠胚胎細(xì)胞增殖明顯降低、而細(xì)胞凋亡明顯增加,同時(shí)有cyclin E的累積。Cul4b基因敲除雜合子小鼠出現(xiàn)子宮內(nèi)發(fā)育遲緩,其原因可能是胎盤發(fā)育異常所致。Cul4b基因神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠發(fā)育大體正常,組織學(xué)分析也未發(fā)現(xiàn)明顯異常,但行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力下降,與人類CUL4B基因突變導(dǎo)致智力低下的臨床表型一致。因此,Cul4b神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠是研究精神發(fā)育遲滯的良好模型,有助于研究精神發(fā)育遲滯發(fā)生的分子機(jī)制和發(fā)現(xiàn)治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:CUL4A , CUL2 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL3 , CUL4A , CUL4B , CUL5 , CUL7 and PARC . The expression of Cul4b in brain , spinal cord , heart , liver , spleen , lung , kidney and small intestine was analyzed by Western blot and immunohistochemistry . In order to obtain Cul4b knockout mice , we constructed a gene targeting vector . After mating with different types of transgenic mice , we obtained two recombinant ES clones .
The mRNA expression of Cul4b mRNA deleted from exon 3 - 5 was found to be a nonsense mutation - mediated mRNA degradation by real - time quantitative PCR analysis .
Cul4b knockout mice were obtained by mating the Cul4b florescent mouse with ElI . alpha . - cre transgenic mice .
In this paper , we found that Cul4b gene knockout mice were able to knock out mice with specific knockout mice . The results showed that Cul4b gene knockout mice were able to knock out mice with specific knockout mice . Cul4b knockout mice developed a good model of mental retardation , which could help to study the molecular mechanism of mental retardation and the discovery of therapeutic targets .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R749;R-332

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7 王s，

本文編號(hào)：1728005