本文選題：阿爾茨海默病　切入點：β淀粉樣蛋白　出處：《山東大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與研究目的 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又稱老年性癡呆,是發(fā)生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變,是一種慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,是老年期癡呆的最常見類型。臨床上表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算力損害、人格和行為的改變等。阿爾茨海默病國際(Alzheimer's Disease International, ADI)發(fā)布年度報告顯示,2010年全世界約有癡呆患者3560萬例,2030年將達到6570萬例,2050年將達1.1540億例,其中約50-75%為AD患者。2010年全球因癡呆帶來的經(jīng)濟負擔(dān)約為6040億美元,約為全球GDP總量的1%。迄今為止,對于AD尚無特效治療方法。究其原因,主要是我們對AD的病因和發(fā)病機制的尚不明了。因此,進一步深入研究AD的病因和發(fā)病機制,并在此基礎(chǔ)上探索防治AD的新方法仍是目前亟需解決的重大問題。 AD組織病理學(xué)上的兩個經(jīng)典的改變?yōu)樯窠?jīng)炎性斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。淀粉樣蛋白級聯(lián)反應(yīng)假說在AD的發(fā)病機制研究中一直占有核心地位,認為Aβ的沉積導(dǎo)致了腦內(nèi)神經(jīng)元的功能異常和死亡。p分泌酶又稱p位點APP裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme1, BACE1),是一種膜結(jié)合的天冬氨酸蛋白酶,是裂解APP產(chǎn)生A β的限速酶。 非編碼NRA (noncoding RNA, ncRNA)是指不能翻譯為蛋白質(zhì),但具有生物學(xué)功能的RNA。長非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)是指長度超過400個核苷酸的非編碼RNA,包括長基因間非編碼RNA (long intergenic noncoding RNA, lincRNA)、自然反義轉(zhuǎn)錄物(natural antisense transcript, NAT)和重復(fù)非編碼RNA(non-coding RNA repeats)等。BACE1反義轉(zhuǎn)錄物(BACE1antisense transcript,BACE1-AS)是一種保守的長約2kb的lncRNA,由定位于11號染色體上的BACE1基因位點(11q23.3)對側(cè)鏈轉(zhuǎn)錄生成。 在AD患者額葉皮層、海馬和內(nèi)嗅皮層等部位均可見BACE1-AS含量的明顯升高和BACE1mRNA含量的輕度升高,提示BACE1-AS可能參與了AD的發(fā)病機制。已有研究表明,BACE1-AS對BACE1mRNA的表達具有明顯的調(diào)節(jié)作用,可以與BACE1mRNA結(jié)合,增加后者的穩(wěn)定性,進而促進Aβ的生成；并且Aβ1-42在體外可以促進BACE1-AS表達的上調(diào),實現(xiàn)Aβ生成的正反饋激活機制。那么,Aβ1-42在體內(nèi)是否同樣具有激活BACE1-AS,增加BACE1mRNA含量,并促進Aβ生成的作用?在APPsw轉(zhuǎn)基因細胞內(nèi),BACE1-AS是否參與了BACE1表達和Aβ生成調(diào)節(jié)機制?A β1-42激活BACE1-AS表達上調(diào)的機制是什么呢? 依據(jù)上述背景,本研究首先在體內(nèi)觀察了外源性Aβ1-42對C57/BL6J小鼠腦內(nèi)BACE1-AS、BACE1表達和Aβ生成的影響；在體外采用AD細胞模型觀察了APPsw基因轉(zhuǎn)入對BACE1-AS、BACE1表達和Aβ生成的影響,以及siRNA干擾抑制BACE1-AS的表達對Aβ生成的影響；在體內(nèi)、體外分別觀察了NF-κB對A β1-42促進BACE1-AS表達上調(diào)和Aβ生成的介導(dǎo)作用機制。 研究內(nèi)容 1. BACE1-AS介導(dǎo)外源性Aβ1-42對細胞和動物BACE1表達和Aβ生成的促進作用機制。 2. BACE1-AS參與APPsw轉(zhuǎn)基因細胞BACE1表達和Aβ生成的作用機制。 3. NF-κB調(diào)節(jié)BACE1-AS表達和Aβ生成的作用機制。 研究方法 1.為了明確A β142在體內(nèi)是否同樣具有激活BACE1-AS,增加BACE1mRNA含量,并促進Aβ生成的作用,首先在部分重復(fù)外源性Aβ1-42在體外對BACE1-AS表達激活作用的基礎(chǔ)上,采用BACE1-AS的siRNA干擾BACE1-AS的表達,觀察其對BACE1mRNA和BACE1蛋白表達,以及對A β1-40生成的影響；然后采用立體定向技術(shù)將外源性A β1-42直接注入C57/BL6J小鼠腦內(nèi)海馬區(qū),觀察小鼠腦內(nèi)BACE1-AS、BACE1mRNA的表達水平和A β1-40的含量。 2.為了明確BACE1-AS是否參與了APPsw轉(zhuǎn)基因細胞內(nèi)BACE1表達和Aβ生成的作用機制,首先采用將APPsw基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HEK293細胞所得的細胞株20E2作為研究對象,觀察APPsw基因轉(zhuǎn)入對體外培養(yǎng)細胞的BACE1-AS、BACE1mRNA表達及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影響；然后采用RNA干擾技術(shù)抑制BACE1-AS的表達,觀察其對BACE1mRNA和BACE1蛋白表達的影響,以及對Aβ1-40和Aβ1-42含量的影響。 3.為了明確NF-κB是否參與了對BACE1-AS表達的調(diào)控,首先檢測了Aβ1-42立體定向注射入海馬后NF-κB的表達情況,Aβ干預(yù)對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞NF-κB的表達情況,以及APPsw轉(zhuǎn)基因細胞內(nèi)NF-κB的表達情況；然后,在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞加入Aβ1-42處理之前給予NF-κB的抑制劑celastrol處理,采用NF-κB的抑制劑celastrol干預(yù)APPsw轉(zhuǎn)基因細胞20E2,分別觀察對BACE1-AS、BACE1mRNA表達,BACE1蛋白含量,以及對Aβ生成的影響。 研究結(jié)果 1. BACE1-AS介導(dǎo)外源性Aβ1-42對細胞和動物BACE1表達和Aβ生成的促進作用機制。 1.1外源性Aβ1-42在體外促進了SH-SY5Y細胞BACE1-AS、BACE1的表達和Aβ的生成。1μM的Aβ1-42作用于體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞后2hr可見BACE1-AS、 BACE1mRNA、以及BACE1蛋白的表達明顯升高,干預(yù)后24hr細胞外液的A β1-40的含量明顯升高。上述結(jié)果與Faghihi MA等的報道結(jié)果一致。BACE1-AS的siRNA預(yù)處理明顯抑制了Aβ1-42對SH-SY5Y細胞BACE1-AS、BACE1的表達和Aβ生成的促進作用。加入siRNA預(yù)處理后,細胞內(nèi)BACE1-AS、BACE1mRNA的含量均明顯降低,細胞內(nèi)BACE1蛋白表達明顯減低,細胞外液Aβ1-40的濃度明顯下降。這說明抑制BACE1-AS的表達可以抑制外源性A β1-42對細胞BACE1表達和Aβ生成的促進作用,從而打斷Aβ通過激活BACE1-AS,增加BACE1mRNA穩(wěn)定性,繼而增加BACE1含量和Aβ生成的正反饋循環(huán)機制。 1.2外源性Aβ1-42在體內(nèi)促進了C57BL/6J小鼠腦內(nèi)BACE1-AS、BACE1的表達和Aβ的生成。與對照組相比,外源性A β1-42干預(yù)3天后,注射側(cè)海馬BACE1-AS、 BACE1mRNA的表達明顯升高,Aβ1-40的含量明顯增高。上述結(jié)果說明,立體定向注射后,外源性Aβ1-42在體內(nèi)同樣可以促進小鼠腦內(nèi)BACE1-AS、BACE1的表達和Aβ生成。 2. BACE1-AS參與APPsw轉(zhuǎn)基因細胞BACE1表達和Aβ生成的作用機制。 2.1APPsw基因轉(zhuǎn)入對細胞內(nèi)BACEl-AS、BACE1表達及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影響。穩(wěn)定轉(zhuǎn)入APPsw所得的20E2細胞內(nèi)BACEl-AS、BACE1mRNA的表達明顯升高,細胞外液中Aβ1-40和Aβ1-42的含量也明顯高于HEK293細胞。這說明在APPsw轉(zhuǎn)基因細胞內(nèi),同樣存在BACE1-AS表達的異常激活。 2.2siRNA抑制APPsw轉(zhuǎn)基因細胞20E2內(nèi)BACE1-AS表達對BACE1mRNA和BACE1蛋白表達及Aβ1-40、Aβ1-42生成的影響。采用siRNA干擾BACE1-AS的表達后,20E2細胞內(nèi)BACE1mRNA和BACE1蛋白的含量均明顯降低,細胞外液中A β1-40和A β1-42的含量也明顯低于未處理組。這說明抑制BACE1-AS的表達,可以抑制內(nèi)源性A β1-42通過促進BACE1-AS異常表達所產(chǎn)生的正反饋循環(huán),從而明顯減少Aβ的生成。 3. NF-κB調(diào)節(jié)BACE1-AS表達和Aβ生成的作用機制。 3.1NF-κB介導(dǎo)了外源性Aβ1-42對BACE1-AS表達的激活作用。在C57BL6J小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)立體定向注射入Aβ1-42后第3天,可以觀察到phospho-NF-κB p65含量的明顯增加。體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞在1μM的A β1-42處理2hr后,phospho-NF-κBp65的含量明顯增加,而加用5μM的celastrol預(yù)處理則可使phospho-NF-κB p65的含量明顯減低。說明Aβ1-42在體內(nèi)外均可以促進NF-κB的活化,celastrol可以抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NF-κB活化。采用celastrol抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NF-κB活化后,BACE1-AS、BACE1mRNA的含量均明顯減少,細胞內(nèi)BACE1蛋白的含量和細胞外液Aβ1-40的含量也明顯降低；而采用BACE1-AS siRNA干擾雖然可以抑制BACE1-AS表達的增強和A β1-40生成的增加,但不能抑制phospho-NF-κB p65含量的增加。由此,我們可以明確,NF-κB介導(dǎo)了外源性Aβ1-42對BACE1-AS表達和Aβ生成的促進作用。 3.2NF-κB介導(dǎo)了APPsw轉(zhuǎn)基因細胞20E2內(nèi)BACE1-AS表達的激活作用。20E2細胞內(nèi)phospho-NF-κB p65的含量明顯高于HEK293細胞。這說明APPsw基因轉(zhuǎn)入在體內(nèi)外均可以引起NF-κB的異常激活。在20E2細胞培養(yǎng)基中加入5μM的celastrol抑制NF-κB的活性后,細胞內(nèi)BACE1-AS、BACE1mRNA的表達明顯降低,BACE1蛋白的含量明顯降低,細胞外液中Aβ1-40和Aβ1-42的含量也明顯低于對照組。而采用BACE1-AS siRNA干擾雖然可以抑制BACE1-AS表達的增強和Aβ1-40、Aβ1-42生成的增加,但不能抑制phospho-NF-κB p65含量的增加。這說明,NF-κB同樣介導(dǎo)了內(nèi)源性Aβ1-42對BACE1-AS表達以及Aβ生成的促進作用。 結(jié)論 1. BACE1-AS介導(dǎo)了外源性Aβ1-42對細胞和動物BACE1表達和Aβ生成的促進作用機制。 2. BACE1-AS參與了APPsw轉(zhuǎn)基因細胞BACE1表達和Aβ生成的作用機制。 3. NF-κB介導(dǎo)了Aβ1-42促進BACE1-AS表達以及Aβ生成的作用機制。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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1 楊清華;;略論人口老齡化對經(jīng)濟社會的影響[J];財經(jīng)界(學(xué)術(shù)版);2010年03期

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本文編號：1566675