本文關(guān)鍵詞： 可卡因 樹突重構(gòu) Rac1 Cdc42 CPu Hippocampus　出處：《南方醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：毒品成癮(drug addiction)是目前世界范圍內(nèi)重大的社會問題,全世界每年約10萬人死于吸毒。同樣地,毒品成癮也已成為我國日益嚴重的社會問題,我國登記在冊的吸毒人員有100萬左右,而實際人數(shù)遠高于此。開展毒品成癮機制的研究,并進一步尋找有效的治療成癮的藥物,具有深遠的社會意義和巨大的市場前景。毒品成癮是一種持久性的腦部疾病。可卡因的長時間暴露可導致神經(jīng)元內(nèi)的持久改變,包括細胞內(nèi)信號通路的改變、神經(jīng)元樹突形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和行為學的可塑性變化。在各種成癮動物模型中發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元的一種持久性適應(yīng)性改變就是紋狀體中多巴胺能中度棘神經(jīng)元(MSNs)的樹突分支增多、樹突棘密度增加。這一神經(jīng)適應(yīng)性改變導致了可卡因成癮誘導的突觸疾結(jié)構(gòu)和功能的改變。盡管已有大量文獻報道了可卡因可誘導紋狀體神經(jīng)元樹突棘增多,但其具體的分子機制的研究還不夠清晰。樹突的重構(gòu)需要骨架蛋白的形態(tài)的改變。已有研究報道,樹突棘形態(tài)受到骨架蛋白結(jié)構(gòu)改變的調(diào)節(jié),而骨架蛋白受到小G蛋白家族的調(diào)節(jié)。小G蛋白家族中最重要的是Rho家族蛋白種的Rac1、RhoA和Cdc42,這三種蛋白相互協(xié)調(diào)、相互依賴,共同調(diào)節(jié)骨架蛋白的結(jié)構(gòu)重組和形成。RhoA和Rac1/Cdc42的作用相反,Rac1/Cdc42對神經(jīng)元的發(fā)生、遷移、生長、維持等起到促進作用,而RhoA對神經(jīng)元的形成和維持起到抑制作用。體內(nèi)Rho有兩種形式,即GDP結(jié)合的無活性狀態(tài)與GTP結(jié)合的活性狀態(tài)。并且,通過體內(nèi)三類蛋白,即鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)、GTPase 激活因子(GTPase activating protein,GAP)與鳥甘酸解離抑制子(guanine nucleotide dissociation inhibitor,GDI),有序地調(diào)控Rho蛋白活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。多巴胺受體包括D1類(D1和D5亞類)和D2類(D2、D3和D4亞類)兩大類,它們在可卡因誘導的紋狀體伏核(NAc)區(qū)神經(jīng)生物學改變中起到了重要的作用。已有研究證實,細胞內(nèi)信號級聯(lián)與多種多巴胺受體相互作用,介導了腦內(nèi)藥物成癮誘導神經(jīng)適應(yīng)性改變。中度棘神經(jīng)元(MSNs)占NAc區(qū)神經(jīng)元總量的90%以上,它可以分為兩大類:一類是表達D1受體的直接通路的MSNs,另一類是表達D2受體的間接通路的MSNs。在紋狀體中,大約50%的MSNs只表達D1受體,35-40%的MSNs只表達D2受體,還有10-15%的MSNs同時表達D1和D2受體。課題組前期探討了 D1和D3多巴胺受體(dopamine receptor)可通過 NMDA(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體、ERK(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號通路相反的調(diào)控可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)。另外有研究報道,可卡因可通過在Ser408/444位點磷酸化MEF2信號,從而抑制MEF2的活性,進而誘導NAc區(qū)的神經(jīng)元發(fā)生樹突重構(gòu),并最終導致行為學的變化。同時,這一研究還發(fā)現(xiàn)在可卡因施用過程中,D1信號可以調(diào)節(jié)MEF2的活性。可卡因誘導的神經(jīng)元樹突分支及樹突棘密度發(fā)生可塑性變化是多種信號通路參與的結(jié)果。本研究分三部分,擬進一步深入探討可卡因成癮誘導的神經(jīng)元樹突重塑的分子機制。主要方法如下:第一部分,我們構(gòu)建了 Rac1的無活性突變體慢病毒(Rac1N17)。利用GST-pull down技術(shù)探討了 7天和28天可卡因處理之后,小鼠(每組9只)紋狀體伏核(NAc)和紋狀體尾殼核(CPu)區(qū)Rac1的活性變化,并利用Western-blotting技術(shù)對Rac1的上下游分子Tiam1、RacGAP1、Cofilin的活性進行了檢測。通過腦立體定位注射技術(shù)將Rac1N17注入到小鼠腦CPu區(qū)(每組6只小鼠),恢復14天后,構(gòu)建5天和28天可卡因成癮模型,分別檢測小鼠CPu區(qū)表達慢病毒的神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度的變化;同時利用行為學敏化實驗(每組8-9只小鼠)和條件性位置偏愛實驗(每組9-12只小鼠)檢測CPu區(qū)表達Rac1N17的小鼠及用Rac1特異性阻斷劑NSC23766預處理的小鼠在可卡因誘導下其行為學的變化。第二部分,我們選用T29-1系CamKⅡ啟動的Cre基因修飾小鼠與LoxP-Cdc42-LoxP小鼠進行雜交,構(gòu)建了前腦特異性的Cdc42基因敲除小鼠,由于T29-1系列基因修飾小鼠的敲除區(qū)域主要在海馬CA1區(qū)的椎體神經(jīng)元,在CA1區(qū)的敲除率達到98%,因此,本部分的研究主要聚焦在海馬CA1區(qū)。通過PCR技術(shù)、Nissl染色、免疫組化染色、Golgi-cox染色對其基因型和形態(tài)學進行了基本的檢測(每組4-6只小鼠)。利用野生型小鼠構(gòu)建慢性可卡因成癮模型,通過GST-pull down技術(shù)檢測了可卡因作用之后海馬區(qū)Cdc42的活性變化(每組9只小鼠),并利用前腦特異性Cdc42基因敲除小鼠和野生型小鼠作對照,構(gòu)建慢性可卡因成癮模型,通過Golgi-cox染色方法檢測了可卡因作用之后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的變化(每組5只小鼠)。第三部分,采用biocytin染色方法對可卡因誘導的發(fā)生樹突重塑的神經(jīng)元進行染色,并利用biocytin、D1和D2免疫熒光共定位技術(shù)研究可卡因誘導的發(fā)生樹突重塑的神經(jīng)元在神經(jīng)元種類中的定位情況(雌、雄小鼠各14只)。在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上,通過利用D1、D3、NMDA、ERK特異性抑制劑阻斷上述信號通路,探究該信號通路在調(diào)節(jié)可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)的過程中,是否是通過MEF2信號通路起作用的(每組4-6只小鼠)。以上三部分工作共同揭示毒品成癮過程中神經(jīng)元樹突重塑可能的分子機制。主要結(jié)果如下:第一部分:1.在7天和28天的可卡因作用之后,分別在可卡因最后一針的15min、45min、2h、4h、8h、24h時間點取材,應(yīng)用GST-pulldown技術(shù)研究NAc和CPu區(qū)Rac1-GTPase的活性變化。同時,對NAc和CPu區(qū)Rac1的上下游分子Tiaml、RacGAP1和Cofilin的活性進行了檢測。結(jié)果顯示:7天和28天的可卡因處理后,NAc 區(qū)的 Rac1-GTPase 活性下降(7 天:F=167.058,P0.001;28 天:F=84.001,P0.001),而 CPu 區(qū)的 Rac1-GTPase 活性升高(7 天:F=31.188,P0.001;28 天:F=35.557,P0.001);在 NAc 區(qū),Rac1 的上游分子 Tiam1活性下降(7 天:F=37.263,P0.001;28 天:F=4.415,P=0.010),而 RacGAP1的活性上升(7 天:F=138.118,P0.001;28 天:F=35.085,P0.001),在CPu 區(qū),Rac1 的上游分子 Tiam1 活性上升(7 天:F=65.944,P0.001;28天:F=19.761,P0.001),而 RacGAP1 的活性下降(7 天:F=22.861,P0.001;28 天:F=29.756,P0.001),NAc 和 CPu 區(qū) Tiam1 和 RacGAP1 的變化趨勢Rac1-GTPase活性變化相協(xié)調(diào),提示可卡因通過調(diào)節(jié)NAc和CPu區(qū)Tiam1和RacGAP1活性,來調(diào)節(jié)Rac1-GTPase的活性;與此同時,我們還發(fā)現(xiàn),Rac1的下游效應(yīng)分子Cofilin在NAc區(qū)磷酸化水平下降(7天:F=84.420,P0.001;28天:F=56.437,P0.001),即活性升高,對骨架蛋白的剪切作用上升,在CPu區(qū)磷酸化水平上升(7天:F=5.191,P=0.007;28天:F=48.762,P0.001),即活性下降,對骨架蛋白的剪切作用下降。這些結(jié)果提示,可卡因可能是通過Rac1信號通路誘導神經(jīng)元發(fā)生結(jié)構(gòu)重塑的。2.應(yīng)用CPu區(qū)立體定位注射RacN17慢病毒以探究CPu區(qū)Rac1是否參與了可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重塑。小鼠CPu立體定位注射慢病毒后14天,制備5天和28天可卡因成癮模型。利用biocytin染色顯示小鼠CPu區(qū)表達Rac1N17的神經(jīng)元的樹突分支和樹突棘密度。結(jié)果顯示:Rac1N17可顯著抑制5天和28天可卡因誘導的CPu區(qū)神經(jīng)元樹突分支的增多(F=73.109,P0.001),并且Rac1N17不影響基礎(chǔ)水平的樹突分支數(shù)量(5天:t=0.392,P=0.703;28天:t=0.652,P=0.529),同時,經(jīng)過28天處理的小鼠整體比5天處理的小鼠樹突分支數(shù)增多(F=51.922,P0.001),可能是兩組小鼠開始時間處理一致,結(jié)束處理時間不一致,兩組小鼠年齡不同所導致的。另外,Rac1N17可顯著抑制可卡因誘導的CPu區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的增加(F=54.848,P0.001),并且Rac1N17可降低基礎(chǔ)水平的神經(jīng)元樹突棘密度(F=54.848,P0.001)。其中,5天可卡因處理主要誘導thin spine密度的上升(F=28.968,P0.001),且Rac1N17的抑制作用也主要體現(xiàn)在thin spine密度的下降(F=28.968,P0.001);而28天可卡因處理誘導thin spine(F=28.968,P0.001)、stubby spine(F=8.793,P0.001)和mushroom spine(P=20.395,P0.001)的密度都出現(xiàn)上升,且Rac1N17的抑制作用也體現(xiàn)在thin spine(F=28.968,P0.001)、stubby spine(F=8.793,P0.001)和mushroom spine(F=20.395,P0.001)的密度都出現(xiàn)下降。提示,CPu區(qū)Rac1參與介導可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重塑。3.應(yīng)用CPu區(qū)表達Rac1N17的小鼠及用Rac1特異性阻斷劑NSC23766預處理的小鼠研究Rac1在可卡因誘導小鼠行為學變化中的作用。小鼠CPu立體定位注射慢病毒后14天,檢測可卡因誘導的行為學變化,結(jié)果顯示:RacN17可顯著降低小鼠對可卡因側(cè)的偏愛(t=2.530,P=0.019),而對可卡因誘導的小鼠的行為學敏化沒有影響(F=0.012,P=0.913)。其次,我們在可卡因之前30分鐘注射NSC23766,檢測可卡因誘導的小鼠行為學的變化,結(jié)果顯示:NSC23766可顯著降低小鼠對可卡因側(cè)的偏愛(t=2.291,P=0.044),同時有降低可卡因誘導的小鼠的行為學敏化的趨勢。這提示Rac1參與了可卡因誘導小鼠行為學的變化。第二部分:1.我們選用T29-1系CamKⅡ啟動的Cre基因修飾小鼠與LoxP-Cdc42-LoxP小鼠進行雜交,構(gòu)建前腦特異性的Cdc42基因敲除小鼠。PCR檢測結(jié)果顯示,我們構(gòu)建的小鼠含有Cre基因,并且LoxP-Cdc42-LoxP基因為純合子,提示我們成功構(gòu)建了前腦特異性的Cdc42基因敲除小鼠。利用Nissl染色對3月大及6月大的前腦特異性的Cdc42基因敲除小鼠的海馬區(qū)進行染色,我們發(fā)現(xiàn),基因敲除小鼠與相應(yīng)年齡的野生型小鼠相比,其海馬的基本形態(tài)沒有顯著差異。利用Cdc42免疫組化染色對3月大和6月大基因敲除海馬區(qū)進行染色,我們發(fā)現(xiàn),3月大小鼠的基因敲除區(qū)域主要集中在CA1區(qū)和CA3區(qū),而6月大小鼠基因敲除區(qū)域分布在整個海馬區(qū),包括CA1、CA3和DG區(qū)。利用Golgi-cox染色對3月大及6月大的前腦特異性的Cdc42基因敲除小鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元進行染色,我們發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠較相應(yīng)年齡的野生型小鼠相比,其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的樹突棘密度出現(xiàn)了顯著下降(3月:t=9.848,P0.001;6月:t=9.600,P0.001)。提示,海馬CA1區(qū)Cdc42的敲除可降低CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的基礎(chǔ)水平。2.對野生型小鼠腹腔注射可卡因,制作28天可卡因成癮模型,在最后一針可卡因后的15min、2h、8h時間點取材,運用GST-pulldown技術(shù)探測可卡因?qū)ｑR區(qū)Cdc42-GTPase活性的影響。結(jié)果顯示,慢性可卡因可激活海馬區(qū)Cdc42-GTPase的活性,在15min升高,2h達到最高,8h回到基礎(chǔ)水平(F=187.121,P0.001),提示可卡因可激活海馬區(qū)Cdc42-GTPase的活性。3.取3月大和6月大腦特異性的Cdc42基因敲除小鼠制作28天可卡因成癮模型,運用Golgi-cox染色對小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘進行顯色。結(jié)果顯示,在3月和6月的野生型小鼠中,可卡因可誘導CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度顯著增加,而CA1區(qū)Cdc42基因的敲除可顯著抑制可卡因誘導的CA1區(qū)樹突棘密度的增加(3 月:F=165.847,P0.00];6 月:F=120.434,P0.001)。提示,Cdc42參與可卡因誘導的CA1區(qū)神經(jīng)元樹突重塑。第三部分:1.運用biocytin染色對可卡因誘導的發(fā)生樹突重塑的神經(jīng)元進行染色,與傳統(tǒng)的Golgi-cox染色相比,biocytin染色能更清晰的顯示出神經(jīng)元樹突分支(F=34.13,P0.00])和樹突棘密度(F=9.97,P0.00])的變化,且可卡因誘導的神經(jīng)元樹突棘密度的增加存在顯著的性別差異(F=33.49,P0.001),即雌性小鼠在可卡因誘導之后,其樹突棘密度顯著高于雄性小鼠的樹突棘密度。運用biocytin與D1、D2免疫熒光共定位染色,我們發(fā)現(xiàn),可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)在D1、D2和D1/D2共定位的神經(jīng)元中都有發(fā)生,且這種分布不存在性別差異(χ2=0.011,P=0.994)。2.運用昆明小鼠制作7天可卡因成癮模型,在最后一針的4h、12h、24h、48h、72h時間點取材,對NAc和CPu區(qū)磷酸化MEF2蛋白進行免疫組化染色,結(jié)果顯示,可卡因可誘導NAc和CPu區(qū)MEF2的磷酸化水平,在4h開始升高,24h 升至最高,72h 降至基礎(chǔ)水平(NAc:F=1351.608,P0.001;CPu:F=922.497,P0.001)。分別給予昆明小鼠D1、D3、NMDA和ERK通路抑制劑SCH23766、NGB2904、MK801和SL327進行預處理后,制作7天可卡因成癮模型,在24h時間點取材,觀察NAc和CPu區(qū)MEF2的磷酸化水平,結(jié)果顯示,NGB2904可顯著升高可卡因誘導的MEF2的磷酸化水平,而SCH23766、MK801和SL327可顯著抑制可卡因誘導的MEF2的磷酸化水平(NAc:F=1893.723,P0.001;CPu:F=1088.314,P0.001),同時,以上幾種抑制劑的單獨使用并不影響MEF2的基礎(chǔ)磷酸化水平(NAc:F=1.387,P=0.254;CPu:和2.330,P=0.070)。運用免疫熒光共定位染色,我們發(fā)現(xiàn),可卡因誘導的MEF2的磷酸化與D1受體神經(jīng)元共定位。結(jié)合課題組前期的研究,我們得出,可卡因可通過D1和D3受體,調(diào)控NMDA受體,進而調(diào)控ERK的活性,進一步調(diào)控MEF2的磷酸化水平,最終對神經(jīng)元的樹突重構(gòu)起到相反的調(diào)控作用。通過上述研究,我們可以得出結(jié)論:(一)CPu區(qū)的Rac1信號通路參與可卡因誘導的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)重塑和行為學的可塑性變化。(二)成功構(gòu)建了前腦特異性的Cdc42基因敲除小鼠,并利用其探討出CA1區(qū)Cdc42的活性參與介導可卡因誘導的CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的增加。(三)可卡因誘導的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)重塑存在性別差異。可卡因誘導的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)重塑發(fā)生于D1、D2和D1/D2共定位的神經(jīng)元中。且D1和D3受體信號通路相反的調(diào)控可卡因誘導的NAc和CPu區(qū)MEF2的磷酸化水平。綜上所述,本研究采用一系列無活性突變體慢病毒、基因敲除技術(shù)、特異性信號通路阻斷劑,通過阻斷CPu區(qū)Rac1的活性、海馬CA1區(qū)Cdc42的表達、D1和D3信號通路的活性,探究了CPu區(qū)的Rac1信號通路、海馬CA1區(qū)Cdc42的活性、D1和D3信號通路在可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)及行為學可塑性變化中的作用。結(jié)果表明,CPu區(qū)的Rac1信號通路、海馬CA1區(qū)Cdc42的活性、D1和D3信號通路參與了可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu),這提示可卡因誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)是多種信號通路共同作用的結(jié)果。上述研究對于我們深入了解可卡因成癮的分子機制有重要的意義,同時也為可卡因成癮的臨床治療提供了諸多啟示。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.64

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本文編號：1478803