本文關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA BACE1-AS促進Aβ聚集及其調(diào)節(jié)BACE1和SERF1a的ceRNA機制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：據(jù)估計在全球有2400萬人患有癡呆癥,其中,大部分都被認為患有阿爾茨海默氏癥疾病。因此,阿爾茨海默氏癥是一個重大的公共衛(wèi)生問題,是重點研究的領(lǐng)域。盡管存在可以減輕阿爾茨海默氏病的癥狀的對癥治療,但其發(fā)病機制亟待更深入的研究。阿爾茨海默氏病(AD)的主要病理標志之一是腦組織中淀粉樣斑塊的。其主要組成部分為淀粉樣蛋白β(Aβ),Aβ的過度生成并聚集對記憶力有明顯負面影響,是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Aβ的產(chǎn)生過程依賴于其前體,淀粉樣前體蛋白(APP),被beta-分泌酶(BACE1)和gama-分泌酶在其內(nèi)部切割。而且目前已知beta-分泌酶(BACE1)在患有阿爾茨海默氏病患者腦組織中表達水平以及其切割酶活性是明顯提高的,因此,BACE1被認為在AD的發(fā)病機制中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。然而,BACE1的調(diào)控因子以及在AD患者腦組織中表達上調(diào)的機制還并不完全清楚。關(guān)于Aβ聚集同樣在AD的發(fā)病過程中起重要作用,淀粉樣斑塊作為AD的病理標志,其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)就是Aβ的聚集,最近有文獻報道Aβ在不同臨床表現(xiàn)的AD患者腦組織中淀粉樣蛋白β(Aβ)的聚集后的分子結(jié)果構(gòu)象不同,Aβ原纖維結(jié)構(gòu)不同,因此,除了Aβ的產(chǎn)生過程中的調(diào)控因子,淀粉樣蛋白β的聚集及參與淀粉樣蛋白β聚集過程的調(diào)控因子及其調(diào)控機制對于理解AD的產(chǎn)生與發(fā)展也至關(guān)重要。目前對于Aβ聚集的研究還比較有限,雖然目前發(fā)現(xiàn)了一個極為重要的促進Aβ聚集的因子----SERF1a,然而,SERF1a的調(diào)控因子還不清楚,其調(diào)控因子在AD患者腦組織中表達是否有改變,這種改變又是通過何種機制發(fā)生的目前也不清楚,因此,找到調(diào)節(jié)SERF1a的關(guān)鍵因子,對于理解AD的發(fā)病機制以及為將來AD臨床診斷和治療都非常重要。長鏈非編碼RNA(lnc RNA),也可能在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用。長鏈非編碼RNA也是一類非編碼RNA,其特點是長度超過200個核苷酸,但并不能翻譯為蛋白質(zhì)。在以前的報告中,Faghihi和他的同事報道了一條lnc RNA,BACE1-AS,在AD患者腦組織中表達增加。BACE1-AS還被發(fā)現(xiàn)可以增加BACE1的m RNA的水平,而這種對BACE1的m RNA的表達水平增加的作用機制,被認為是通過BACE1-AS通過其與BACE1的m RNA互補的區(qū)段與BACE1的m RNA相結(jié)合后,使得BACE1的m RNA的穩(wěn)定性增加,從而降解減少使得BACE1的m RNA的表達水平增加。然而,作為新發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA,目前還不清楚何種因子在調(diào)節(jié)BACE1-AS,而且BACE1-AS是否有其他的生物學功能和調(diào)節(jié)的目標更不清楚。最近有幾個報告已經(jīng)提供了一個lnc RNA通過與micro RNA(mi RNA)相互作用而發(fā)揮功能的作用機制模型,那就是lnc RNA可充當競爭性內(nèi)源RNA(ce RNA)而發(fā)揮作用。該機制模型的基本含義是,內(nèi)源性的RNA可以互相競爭性的結(jié)合mi RNA,從而保護同樣被這些mi RNA抑制的其他內(nèi)源性RNA。這種ce RNA機制是一種廣泛存在的RNA相互作用并調(diào)節(jié)的機制,然而該機制是否在神經(jīng)系統(tǒng)中起作用,尤其是否參與AD的發(fā)病機制還不清楚。因此,本博士研究課題主要圍繞BACE1-AS這條長鏈非編碼RNA展開,旨在尋求以上問題的答案。其主要的研究方案是通過過表達以及干擾BACE1-AS,研究AD相關(guān)因子以及病理過程的改變。我們通過系統(tǒng)的實驗發(fā)現(xiàn),BACE1-AS可以通過發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的作用,與BACE1競爭性的結(jié)合靶向BACE1的mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761,從而保護BACE1不被這些mi RNA抑制,從而上調(diào)BACE1,促進Aβ生成。BACE1-AS還可以與SERF1a BACE1競爭性的結(jié)合靶向SERF1a的mir-1273,mir-1285和mir-3064,從而保護SERF1a,使SERF1a表達上調(diào),進而促進Aβ聚集。由于Aβ的生成和聚集是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此我們的發(fā)現(xiàn)表明BACE1-AS在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用,并提出AD發(fā)病的新的機制。第一部分:長鏈非編碼RNA BACE1-AS促進Aβ的聚集方法:(1)在構(gòu)建Aβ過量生成的細胞模型,并在該模型中,過表達以及干擾BACE1-AS后,通過Western-blot檢測Aβ的量以及聚集情況。(2)排除BACE1-AS對BACE1的影響后,用Western-blot檢測BACE1-AS對Aβ聚集的影響。(3)利用免疫熒光檢測過表達以及干擾BACE1-AS后,Aβ聚集情況。(4)體外Aβ聚集動態(tài)檢測實驗實時檢測過表達及干擾BACE1-AS后的細胞裂解產(chǎn)物對Aβ體外聚集動力學影響。(5)cck8CCK-8細胞活性檢測試劑盒以及Tunel TUNEL檢測試劑盒檢測BACE1-AS影響Aβ后的細胞毒作用。(6)Western-blot檢測BACE1-AS影響Aβ后的Tau蛋白磷酸化水平的變化。(7)通過直接添加BACE1-AS的RNA于體外聚集實驗中,明確BACE1-AS對Aβ的聚集的影響是直接效應(yīng)還是間接效應(yīng)。(8)篩選BACE1-AS對Aβ聚集影響的調(diào)節(jié)因子。(9)證實選出調(diào)控因子的作用。(10)在不同細胞中驗證BACE1-AS對SERF1a影響的普遍性。(11)敲除Dicer后研究BACE1-AS對SERF1a的影響,明確mi RNA是否參與調(diào)控。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建Aβ過量生成的細胞模型,并通過Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),相對于對照,過表達BACE1-AS后,Aβ生成增加,并且有更多更高分子量的Aβ聚集物出現(xiàn),干擾BACE1-AS后,Aβ生成減少,并且有高分子量的Aβ聚集物減少,最高分子量大小低于對照的最高聚集物分子量大小。(2)直接過量表達Aβ,使得BACE1-AS對AS的含量影響不大的情況下,Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),相對于對照,過表達BACE1-AS后,依然有更高分子量的Aβ聚集物出現(xiàn),干擾BACE1-AS后,最高分子量大小低于對照的最高聚集物分子量大小。(3)利用免疫熒光檢測證明BACE1-AS促進Aβ聚集。(4)體外Aβ聚集動態(tài)檢測實驗證實過表達BACE1-AS的細胞裂解物使Aβ聚集加快。(5)CCK-8細胞活性檢測試劑盒以及TUNEL檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)BACE1-AS影響Aβ后細胞毒作用增加。(6)Western-blot證明BACE1-AS影響Aβ后的Tau蛋白磷酸化水平升高。(7)直接添加BACE1-AS的RNA于體外聚集實驗中,發(fā)現(xiàn)BACE1-AS本身不能直接促進Aβ的聚集。(8)通過過表達BACE1-AS,篩選AD相關(guān)基因的變化水平,明確SERF1a受BACE1-AS的調(diào)控。(9)實驗證實BACE1-AS確實調(diào)控SERF1a的表水平。(10)BACE1-AS對SERF1a的影響具有神經(jīng)組織特異性。(11)敲除Dicer后,BACE1-AS對SERF1a的上調(diào)減弱,說明mi RNA參與BACE1-AS對SERF1a的調(diào)控。結(jié)論:體外實驗證實長鏈非編碼RNA BACE1-AS促進Aβ的聚集,且Aβ的生成增加不是該過程的必要條件。BACE1-AS本身不直接影響Aβ的聚集,而是通過上調(diào)SERF1a促進Aβ的聚集。BACE1-AS對SERF1a的影響具有神經(jīng)組織特異性,mi RNA參與BACE1-AS對SERF1a的調(diào)控過程。第二部分:BACE1-AS通過競爭內(nèi)源RNA機制上調(diào)SERF1a方法:(1)生物信息學分析篩選BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(2)熒光素報告基因?qū)嶒?,qrt-PCR,Western-blot等實驗篩選確認BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(3)mi RNA結(jié)合位點突變體實驗研究BACE1-AS對SERF1a的影響是否依賴于與mi RNA的結(jié)合。(4)精確定量測定SH-SY5Y細胞中相關(guān)因子表達拷貝數(shù)。(5)CCK-8,qrt-PCR,Western-blot等實驗探索這些mi RNA對AD相關(guān)表型是否有影響。(6)qrt-PCR檢測BACE1-AS對這些mi RNA是否有影響。(7)Northern-blot以及mi RNA半衰期檢測BACE1-AS對mi RNA降解的影響。(8)RNA免疫共沉淀研究BACE1-AS與mi RNA是否有直接結(jié)合。(9)競爭實驗證探索BACE1-AS是否通過競爭性結(jié)合mi RNA機制保護SERF1a。結(jié)果:(1)生物信息學分析篩選出9條BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(2)熒光素報告基因?qū)嶒?qrt-PCR,Western-blot等實驗篩選確認mir3064,mir1285,mir1273為BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(3)突變mi RNA結(jié)合位點的BACE1-AS不能上調(diào)SERF1a。(4)精確定量測定SH-SY5Y細胞中BACE1-AS,SERF1a以及三條mi RNA有互相形成ce RNA機制的拷貝數(shù)基礎(chǔ)。(5)CCK-8,qrt-PCR,Western-blot等實驗發(fā)現(xiàn)三條mi RNA抑制AD相關(guān)表型,是AD的保護因子。(6)qrt-PCR發(fā)現(xiàn)BACE1-AS下調(diào)這些mi RNA的成熟體而不影響其前體。(7)Northern-blot以及mi RNA半衰期檢測證實BACE1-AS促進三條mi RNA的降解。(8)RNA免疫共沉淀證實BACE1-AS與mi RNA直接結(jié)合。(9)競爭實驗證實BACE1-AS通過競爭性結(jié)合mi RNA機制保護SERF1a。結(jié)論:mir3064,mir1285,mir1273既可以下調(diào)BACE1-AS又可以下調(diào)SERF1a,BACE1-AS通過競爭內(nèi)源性RNA機制,與SERF1a競爭性的結(jié)合mir3064,mir1285,mir1273,保護SERF1a不被這些mi RNA降解,從而上調(diào)SERF1a。第三部分:BACE1-AS通過競爭內(nèi)源RNA機制上調(diào)BACE1方法:(1)構(gòu)建缺失了與BACE1形成雙鏈區(qū)段的突變型BACE1-AS-Δ,研究BACE1-AS其他區(qū)段對BACE1是否有影響。(2)構(gòu)建BACE1-AS中僅含與BACE1形成雙鏈的互補區(qū)段的突變型BACE1-AS-complementary,研究BACE1-AS對BACE1的影響是否依賴形成雙鏈RNA。(3)生物信息學方法篩選,熒光素報告基因?qū)嶒?qrt-PCR,Western-blot等實驗證實是否存在BACE1-AS與BACE1分享的mi RNA。(4)用第二部分方法證實BACE1-AS通過競爭內(nèi)源RNA機制上調(diào)BACE1。結(jié)果:(1)缺失了與BACE1形成雙鏈區(qū)段后,BACE1-AS-Δ依然可以上調(diào)BACE1。(2)過表達僅含與BACE1形成雙鏈的互補區(qū)段的突變型BACE1-AS-complementary表達載體,BACE1不能被上調(diào)。(3)找到并證實BACE1-AS與BACE1分享mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485,mir-761。(4)qrt-PCR發(fā)現(xiàn)BACE1-AS下調(diào)這些mi RNA的成熟體而不影響其體,Northern-blot以及mi RNA半衰期檢測證實BACE1-AS促進這些mi RNA的降解,RNA免疫共沉淀證實BACE1-AS與mi RNA直接結(jié)合,競爭實驗證實BACE1-AS通過競爭性結(jié)合mi RNA機制保護SERF1a。結(jié)論:BACE1-AS對于BACE1的影響機制不限于互相形成雙鏈RNA,BACE1-AS對BACE1的上調(diào)依賴于與mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761的結(jié)合。BACE1-AS通過競爭內(nèi)源性RNA機制,與BACE1競爭性的結(jié)合mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761,保護BACE1不被這些mi RNA降解,從而上調(diào)BACE1。第四部分:動物實驗及AD病人中研究相關(guān)基因表達情況方法:(1)在APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦組織通過注射BACE1-AS過表達慢病毒顆粒(LV-BACE1-AS)過表達BACE1-AS,體內(nèi)實驗研究BACE1-AS對Aβ的影響。(2)檢測BACE1-AS在體內(nèi)對BACE1和SERF1a以及相應(yīng)mi RNA的影響。(3)分析已有GEO數(shù)據(jù)庫中AD病人腦組織中基因表達情況,分析本文相關(guān)基因表達情況。結(jié)果:APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達BACE1-AS后發(fā)現(xiàn):(1)Aβ生成和聚集增加;(2)腦組織中SERF和BACE1表達上調(diào),靶向BACE1的mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485,和靶向SERF1a的mir3064,mir1285和mir1273表達下調(diào)。分析已有GEO數(shù)據(jù)庫中AD病人腦組織中基因表達情況后發(fā)現(xiàn)。(3)共同靶向BACE1-AS和BACE1的mi R-485,mi R-107以及共同靶向BACE1-AS和SERF1a的mi R-1273d,mi R-3064在AD患者腦組織中明顯下調(diào);(4)首次證實SERF1a在AD病人腦組織中表達上調(diào),且其表達量與BACE1,TAU,PSEN1以及PSEN2正相關(guān)。結(jié)論:體內(nèi)實驗證實BACE1-AS促進Aβ生成和聚集,并佐證體外實驗證實的BACE1-AS通過ce RNA機制實現(xiàn)對BACE1和SERF1a的上調(diào)作用。AD患者腦組織中確實有SERF1a表達的上調(diào),并有本文提出的ce RNA機制相關(guān)因子,如mi R-485,mi R-107,mi R-1273d,和mi R-3064的相應(yīng)變化。小結(jié)聚集的淀粉樣蛋白-β(Aβ)是阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征之一,Aβ以及其生成和聚集的調(diào)節(jié)因子受到廣泛關(guān)注,然而,這些因子在AD的發(fā)病過程中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制卻所知甚少。我們通過系統(tǒng)的實驗報道了一些證據(jù)說明一條被稱作BACE1-AS的已知長鏈非編碼RNA可以通過上調(diào)SERF1a來促進Aβ的聚集,而SERF1a被證實是淀粉樣蛋白質(zhì)聚集的直接調(diào)節(jié)因子,并可以增加Aβ的細胞毒性。我們還發(fā)現(xiàn)BACE1-AS在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)BACE1和SERF1a,其機制是通過發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的作用,分別與BACE1以及SERF1a競爭性的結(jié)合靶向BACE1和SERF1a的mi RNA,從而保護BACE1和SERF1a。我們還通過體內(nèi)實驗在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)過表達BACE1-AS后,SERF1a和BACE1表達上升,相應(yīng)mi RNA表達下降,Aβ的聚集增加。最后通過分析AD患者腦組織中相關(guān)基因的表達水平進一步證實BACE1-AS在AD中的作用。我們的結(jié)果提出BACE1-AS可以作為內(nèi)源性競爭RNA吸附mi RNA,調(diào)控BACE1和SERF1a,使三者到達穩(wěn)定的動態(tài)平衡,該調(diào)控過程的紊亂會造成Aβ的聚集增多,促進AD相關(guān)的病理過程的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16

【共引文獻】

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本文編號：1422074