本文關(guān)鍵詞：長(zhǎng)鏈非編碼RNA BACE1-AS促進(jìn)Aβ聚集及其調(diào)節(jié)BACE1和SERF1a的ceRNA機(jī)制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：據(jù)估計(jì)在全球有2400萬人患有癡呆癥,其中,大部分都被認(rèn)為患有阿爾茨海默氏癥疾病。因此,阿爾茨海默氏癥是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題,是重點(diǎn)研究的領(lǐng)域。盡管存在可以減輕阿爾茨海默氏病的癥狀的對(duì)癥治療,但其發(fā)病機(jī)制亟待更深入的研究。阿爾茨海默氏病(AD)的主要病理標(biāo)志之一是腦組織中淀粉樣斑塊的。其主要組成部分為淀粉樣蛋白β(Aβ),Aβ的過度生成并聚集對(duì)記憶力有明顯負(fù)面影響,是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Aβ的產(chǎn)生過程依賴于其前體,淀粉樣前體蛋白(APP),被beta-分泌酶(BACE1)和gama-分泌酶在其內(nèi)部切割。而且目前已知beta-分泌酶(BACE1)在患有阿爾茨海默氏病患者腦組織中表達(dá)水平以及其切割酶活性是明顯提高的,因此,BACE1被認(rèn)為在AD的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。然而,BACE1的調(diào)控因子以及在AD患者腦組織中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制還并不完全清楚。關(guān)于Aβ聚集同樣在AD的發(fā)病過程中起重要作用,淀粉樣斑塊作為AD的病理標(biāo)志,其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)就是Aβ的聚集,最近有文獻(xiàn)報(bào)道Aβ在不同臨床表現(xiàn)的AD患者腦組織中淀粉樣蛋白β(Aβ)的聚集后的分子結(jié)果構(gòu)象不同,Aβ原纖維結(jié)構(gòu)不同,因此,除了Aβ的產(chǎn)生過程中的調(diào)控因子,淀粉樣蛋白β的聚集及參與淀粉樣蛋白β聚集過程的調(diào)控因子及其調(diào)控機(jī)制對(duì)于理解AD的產(chǎn)生與發(fā)展也至關(guān)重要。目前對(duì)于Aβ聚集的研究還比較有限,雖然目前發(fā)現(xiàn)了一個(gè)極為重要的促進(jìn)Aβ聚集的因子----SERF1a,然而,SERF1a的調(diào)控因子還不清楚,其調(diào)控因子在AD患者腦組織中表達(dá)是否有改變,這種改變又是通過何種機(jī)制發(fā)生的目前也不清楚,因此,找到調(diào)節(jié)SERF1a的關(guān)鍵因子,對(duì)于理解AD的發(fā)病機(jī)制以及為將來AD臨床診斷和治療都非常重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lnc RNA),也可能在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA也是一類非編碼RNA,其特點(diǎn)是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸,但并不能翻譯為蛋白質(zhì)。在以前的報(bào)告中,Faghihi和他的同事報(bào)道了一條lnc RNA,BACE1-AS,在AD患者腦組織中表達(dá)增加。BACE1-AS還被發(fā)現(xiàn)可以增加BACE1的m RNA的水平,而這種對(duì)BACE1的m RNA的表達(dá)水平增加的作用機(jī)制,被認(rèn)為是通過BACE1-AS通過其與BACE1的m RNA互補(bǔ)的區(qū)段與BACE1的m RNA相結(jié)合后,使得BACE1的m RNA的穩(wěn)定性增加,從而降解減少使得BACE1的m RNA的表達(dá)水平增加。然而,作為新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,目前還不清楚何種因子在調(diào)節(jié)BACE1-AS,而且BACE1-AS是否有其他的生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)的目標(biāo)更不清楚。最近有幾個(gè)報(bào)告已經(jīng)提供了一個(gè)lnc RNA通過與micro RNA(mi RNA)相互作用而發(fā)揮功能的作用機(jī)制模型,那就是lnc RNA可充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ce RNA)而發(fā)揮作用。該機(jī)制模型的基本含義是,內(nèi)源性的RNA可以互相競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合mi RNA,從而保護(hù)同樣被這些mi RNA抑制的其他內(nèi)源性RNA。這種ce RNA機(jī)制是一種廣泛存在的RNA相互作用并調(diào)節(jié)的機(jī)制,然而該機(jī)制是否在神經(jīng)系統(tǒng)中起作用,尤其是否參與AD的發(fā)病機(jī)制還不清楚。因此,本博士研究課題主要圍繞BACE1-AS這條長(zhǎng)鏈非編碼RNA展開,旨在尋求以上問題的答案。其主要的研究方案是通過過表達(dá)以及干擾BACE1-AS,研究AD相關(guān)因子以及病理過程的改變。我們通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BACE1-AS可以通過發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA的作用,與BACE1競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合靶向BACE1的mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761,從而保護(hù)BACE1不被這些mi RNA抑制,從而上調(diào)BACE1,促進(jìn)Aβ生成。BACE1-AS還可以與SERF1a BACE1競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合靶向SERF1a的mir-1273,mir-1285和mir-3064,從而保護(hù)SERF1a,使SERF1a表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)Aβ聚集。由于Aβ的生成和聚集是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此我們的發(fā)現(xiàn)表明BACE1-AS在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用,并提出AD發(fā)病的新的機(jī)制。第一部分:長(zhǎng)鏈非編碼RNA BACE1-AS促進(jìn)Aβ的聚集方法:(1)在構(gòu)建Aβ過量生成的細(xì)胞模型,并在該模型中,過表達(dá)以及干擾BACE1-AS后,通過Western-blot檢測(cè)Aβ的量以及聚集情況。(2)排除BACE1-AS對(duì)BACE1的影響后,用Western-blot檢測(cè)BACE1-AS對(duì)Aβ聚集的影響。(3)利用免疫熒光檢測(cè)過表達(dá)以及干擾BACE1-AS后,Aβ聚集情況。(4)體外Aβ聚集動(dòng)態(tài)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)過表達(dá)及干擾BACE1-AS后的細(xì)胞裂解產(chǎn)物對(duì)Aβ體外聚集動(dòng)力學(xué)影響。(5)cck8CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒以及Tunel TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)BACE1-AS影響Aβ后的細(xì)胞毒作用。(6)Western-blot檢測(cè)BACE1-AS影響Aβ后的Tau蛋白磷酸化水平的變化。(7)通過直接添加BACE1-AS的RNA于體外聚集實(shí)驗(yàn)中,明確BACE1-AS對(duì)Aβ的聚集的影響是直接效應(yīng)還是間接效應(yīng)。(8)篩選BACE1-AS對(duì)Aβ聚集影響的調(diào)節(jié)因子。(9)證實(shí)選出調(diào)控因子的作用。(10)在不同細(xì)胞中驗(yàn)證BACE1-AS對(duì)SERF1a影響的普遍性。(11)敲除Dicer后研究BACE1-AS對(duì)SERF1a的影響,明確mi RNA是否參與調(diào)控。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建Aβ過量生成的細(xì)胞模型,并通過Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相對(duì)于對(duì)照,過表達(dá)BACE1-AS后,Aβ生成增加,并且有更多更高分子量的Aβ聚集物出現(xiàn),干擾BACE1-AS后,Aβ生成減少,并且有高分子量的Aβ聚集物減少,最高分子量大小低于對(duì)照的最高聚集物分子量大小。(2)直接過量表達(dá)Aβ,使得BACE1-AS對(duì)AS的含量影響不大的情況下,Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相對(duì)于對(duì)照,過表達(dá)BACE1-AS后,依然有更高分子量的Aβ聚集物出現(xiàn),干擾BACE1-AS后,最高分子量大小低于對(duì)照的最高聚集物分子量大小。(3)利用免疫熒光檢測(cè)證明BACE1-AS促進(jìn)Aβ聚集。(4)體外Aβ聚集動(dòng)態(tài)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)BACE1-AS的細(xì)胞裂解物使Aβ聚集加快。(5)CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒以及TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BACE1-AS影響Aβ后細(xì)胞毒作用增加。(6)Western-blot證明BACE1-AS影響Aβ后的Tau蛋白磷酸化水平升高。(7)直接添加BACE1-AS的RNA于體外聚集實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)BACE1-AS本身不能直接促進(jìn)Aβ的聚集。(8)通過過表達(dá)BACE1-AS,篩選AD相關(guān)基因的變化水平,明確SERF1a受BACE1-AS的調(diào)控。(9)實(shí)驗(yàn)證實(shí)BACE1-AS確實(shí)調(diào)控SERF1a的表水平。(10)BACE1-AS對(duì)SERF1a的影響具有神經(jīng)組織特異性。(11)敲除Dicer后,BACE1-AS對(duì)SERF1a的上調(diào)減弱,說明mi RNA參與BACE1-AS對(duì)SERF1a的調(diào)控。結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA BACE1-AS促進(jìn)Aβ的聚集,且Aβ的生成增加不是該過程的必要條件。BACE1-AS本身不直接影響Aβ的聚集,而是通過上調(diào)SERF1a促進(jìn)Aβ的聚集。BACE1-AS對(duì)SERF1a的影響具有神經(jīng)組織特異性,mi RNA參與BACE1-AS對(duì)SERF1a的調(diào)控過程。第二部分:BACE1-AS通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA機(jī)制上調(diào)SERF1a方法:(1)生物信息學(xué)分析篩選BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(2)熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),,qrt-PCR,Western-blot等實(shí)驗(yàn)篩選確認(rèn)BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(3)mi RNA結(jié)合位點(diǎn)突變體實(shí)驗(yàn)研究BACE1-AS對(duì)SERF1a的影響是否依賴于與mi RNA的結(jié)合。(4)精確定量測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞中相關(guān)因子表達(dá)拷貝數(shù)。(5)CCK-8,qrt-PCR,Western-blot等實(shí)驗(yàn)探索這些mi RNA對(duì)AD相關(guān)表型是否有影響。(6)qrt-PCR檢測(cè)BACE1-AS對(duì)這些mi RNA是否有影響。(7)Northern-blot以及mi RNA半衰期檢測(cè)BACE1-AS對(duì)mi RNA降解的影響。(8)RNA免疫共沉淀研究BACE1-AS與mi RNA是否有直接結(jié)合。(9)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)證探索BACE1-AS是否通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mi RNA機(jī)制保護(hù)SERF1a。結(jié)果:(1)生物信息學(xué)分析篩選出9條BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(2)熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),qrt-PCR,Western-blot等實(shí)驗(yàn)篩選確認(rèn)mir3064,mir1285,mir1273為BACE1-AS與SERF1a分享的mi RNA。(3)突變mi RNA結(jié)合位點(diǎn)的BACE1-AS不能上調(diào)SERF1a。(4)精確定量測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞中BACE1-AS,SERF1a以及三條mi RNA有互相形成ce RNA機(jī)制的拷貝數(shù)基礎(chǔ)。(5)CCK-8,qrt-PCR,Western-blot等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三條mi RNA抑制AD相關(guān)表型,是AD的保護(hù)因子。(6)qrt-PCR發(fā)現(xiàn)BACE1-AS下調(diào)這些mi RNA的成熟體而不影響其前體。(7)Northern-blot以及mi RNA半衰期檢測(cè)證實(shí)BACE1-AS促進(jìn)三條mi RNA的降解。(8)RNA免疫共沉淀證實(shí)BACE1-AS與mi RNA直接結(jié)合。(9)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)BACE1-AS通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mi RNA機(jī)制保護(hù)SERF1a。結(jié)論:mir3064,mir1285,mir1273既可以下調(diào)BACE1-AS又可以下調(diào)SERF1a,BACE1-AS通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA機(jī)制,與SERF1a競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合mir3064,mir1285,mir1273,保護(hù)SERF1a不被這些mi RNA降解,從而上調(diào)SERF1a。第三部分:BACE1-AS通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA機(jī)制上調(diào)BACE1方法:(1)構(gòu)建缺失了與BACE1形成雙鏈區(qū)段的突變型BACE1-AS-Δ,研究BACE1-AS其他區(qū)段對(duì)BACE1是否有影響。(2)構(gòu)建BACE1-AS中僅含與BACE1形成雙鏈的互補(bǔ)區(qū)段的突變型BACE1-AS-complementary,研究BACE1-AS對(duì)BACE1的影響是否依賴形成雙鏈RNA。(3)生物信息學(xué)方法篩選,熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),qrt-PCR,Western-blot等實(shí)驗(yàn)證實(shí)是否存在BACE1-AS與BACE1分享的mi RNA。(4)用第二部分方法證實(shí)BACE1-AS通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA機(jī)制上調(diào)BACE1。結(jié)果:(1)缺失了與BACE1形成雙鏈區(qū)段后,BACE1-AS-Δ依然可以上調(diào)BACE1。(2)過表達(dá)僅含與BACE1形成雙鏈的互補(bǔ)區(qū)段的突變型BACE1-AS-complementary表達(dá)載體,BACE1不能被上調(diào)。(3)找到并證實(shí)BACE1-AS與BACE1分享mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485,mir-761。(4)qrt-PCR發(fā)現(xiàn)BACE1-AS下調(diào)這些mi RNA的成熟體而不影響其體,Northern-blot以及mi RNA半衰期檢測(cè)證實(shí)BACE1-AS促進(jìn)這些mi RNA的降解,RNA免疫共沉淀證實(shí)BACE1-AS與mi RNA直接結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)BACE1-AS通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mi RNA機(jī)制保護(hù)SERF1a。結(jié)論:BACE1-AS對(duì)于BACE1的影響機(jī)制不限于互相形成雙鏈RNA,BACE1-AS對(duì)BACE1的上調(diào)依賴于與mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761的結(jié)合。BACE1-AS通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA機(jī)制,與BACE1競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761,保護(hù)BACE1不被這些mi RNA降解,從而上調(diào)BACE1。第四部分:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及AD病人中研究相關(guān)基因表達(dá)情況方法:(1)在APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦組織通過注射BACE1-AS過表達(dá)慢病毒顆粒(LV-BACE1-AS)過表達(dá)BACE1-AS,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究BACE1-AS對(duì)Aβ的影響。(2)檢測(cè)BACE1-AS在體內(nèi)對(duì)BACE1和SERF1a以及相應(yīng)mi RNA的影響。(3)分析已有GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中AD病人腦組織中基因表達(dá)情況,分析本文相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果:APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)BACE1-AS后發(fā)現(xiàn):(1)Aβ生成和聚集增加;(2)腦組織中SERF和BACE1表達(dá)上調(diào),靶向BACE1的mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485,和靶向SERF1a的mir3064,mir1285和mir1273表達(dá)下調(diào)。分析已有GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中AD病人腦組織中基因表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)。(3)共同靶向BACE1-AS和BACE1的mi R-485,mi R-107以及共同靶向BACE1-AS和SERF1a的mi R-1273d,mi R-3064在AD患者腦組織中明顯下調(diào);(4)首次證實(shí)SERF1a在AD病人腦組織中表達(dá)上調(diào),且其表達(dá)量與BACE1,TAU,PSEN1以及PSEN2正相關(guān)。結(jié)論:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)BACE1-AS促進(jìn)Aβ生成和聚集,并佐證體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)的BACE1-AS通過ce RNA機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)BACE1和SERF1a的上調(diào)作用。AD患者腦組織中確實(shí)有SERF1a表達(dá)的上調(diào),并有本文提出的ce RNA機(jī)制相關(guān)因子,如mi R-485,mi R-107,mi R-1273d,和mi R-3064的相應(yīng)變化。小結(jié)聚集的淀粉樣蛋白-β(Aβ)是阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征之一,Aβ以及其生成和聚集的調(diào)節(jié)因子受到廣泛關(guān)注,然而,這些因子在AD的發(fā)病過程中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制卻所知甚少。我們通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道了一些證據(jù)說明一條被稱作BACE1-AS的已知長(zhǎng)鏈非編碼RNA可以通過上調(diào)SERF1a來促進(jìn)Aβ的聚集,而SERF1a被證實(shí)是淀粉樣蛋白質(zhì)聚集的直接調(diào)節(jié)因子,并可以增加Aβ的細(xì)胞毒性。我們還發(fā)現(xiàn)BACE1-AS在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)BACE1和SERF1a,其機(jī)制是通過發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA的作用,分別與BACE1以及SERF1a競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合靶向BACE1和SERF1a的mi RNA,從而保護(hù)BACE1和SERF1a。我們還通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BACE1-AS后,SERF1a和BACE1表達(dá)上升,相應(yīng)mi RNA表達(dá)下降,Aβ的聚集增加。最后通過分析AD患者腦組織中相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)BACE1-AS在AD中的作用。我們的結(jié)果提出BACE1-AS可以作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA吸附mi RNA,調(diào)控BACE1和SERF1a,使三者到達(dá)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡,該調(diào)控過程的紊亂會(huì)造成Aβ的聚集增多,促進(jìn)AD相關(guān)的病理過程的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749.16

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1422074