本文關(guān)鍵詞：rhMG53聯(lián)合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的治療作用　出處：《鄭州大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是與年齡密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,隨著我國社會的老齡化,AD患者呈現(xiàn)逐年上升趨勢。當前,AD的發(fā)病機制的闡明和治療手段的改進仍然是醫(yī)學界的難題,干細胞移植治療作為新的疾病治療方案,為AD的治療帶來了希望。提高移植治療的干細胞的生存能力,促進更多的干細胞遷移到腦組織發(fā)揮作用,對于提高干細胞移植治療效果具有重要作用。MG53蛋白(Mitsugumin53 protein)是一種新發(fā)現(xiàn)的TRIM家族肌特異性蛋白,在細胞膜損傷修復(fù)和多種急性器官損傷保護中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是重組人MG53蛋白(recombinant human Mitsugumin53 protein,rhMG53)對人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)氧化損傷和AD慢性病理狀態(tài)下的保護作用未見報道。目的體外實驗建立hUC-MSCs的H2O2氧化損傷模型研究rhMG53對hUC-MSCs氧化損傷的保護作用。體內(nèi)實驗研究rhMG53聯(lián)合hUC-MSCs移植對APP+轉(zhuǎn)基因模型鼠的干預(yù)和治療作用,為進一步了解MG53蛋白的功能并探討對hUC-MSCs保護和對AD的治療作用提供科學依據(jù)。方法1、體外實驗研究rhMG53對hUC-MSCs氧化損傷的保護作用使用組織塊培養(yǎng)法從健康人臍帶分離培養(yǎng)hUC-MSCs,P3代細胞建立H2O2損傷模型;CCK-8法檢測rhMG53蛋白對細胞增殖的影響,篩選合適處理條件,確定實驗分組為NC組,rhMG53組,H2O2組,預(yù)處理rhMG53組(Pre組);Transwell小室觀察rhMG53蛋白對細胞遷移的影響;流式細胞術(shù)檢測rhMG53蛋白對細胞周期和細胞凋亡的影響;β-半乳糖苷酶染色檢測rhMG53蛋白對細胞衰老的影響;分光光度法檢測rhmg53蛋白對細胞sod活性和mda含量的影響。2、體內(nèi)實驗研究rhmg53聯(lián)合huc-mscs移植對阿爾茨海默鼠的治療作用使用4月齡app+轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型鼠,分為app+組,huc-mscs組,rhmg53組,rhmg53聯(lián)合huc-mscs組(聯(lián)合組);一周后,免疫組化檢測小鼠腦內(nèi)huc-mscs移植的遷移率;兩周后,用跑步機檢測小鼠的運動能力;四周后,morris水迷宮檢測各組小鼠的學習和記憶能力;分光光度法檢測各組小鼠血清sod的活性和mda的含量;qrt-pcr和westernblot檢測各組小鼠腦組織中衰老相關(guān)基因(sirt1、sirt2、pcna、p16、、p21、p53)的表達變化;免疫組化法檢測各組小鼠腦組織神經(jīng)標志物(dcx、nestin、nse)表達。結(jié)果1、體外實驗發(fā)現(xiàn),p3代huc-mscs貼壁生長,呈梭型,旋渦狀,表面光滑,輪廓清晰;h2o2處理后,細胞貼壁能力減低,細胞貼壁寬度變窄,表面有泡狀突起。h2o2對huc-mscs具有濃度和時間依賴性的損傷作用,考慮細胞的增殖能力和死亡率,選用200μmh2o2處理16h作為氧化損傷模型的最適條件。rhmg53處理對細胞的增殖能力具有濃度依賴的增強作用,選用30μg/mlrhmg53作為實驗使用濃度。與nc組相比,rhmg53組細胞增殖和遷移能力顯著提高,s期比例變化差異不大,細胞衰老和凋亡比例顯著降低,細胞sod活力顯著增加,mda含量顯著降低;h2o2組細胞增殖、遷移能力和s期細胞比例顯著降低,細胞衰老和凋亡比例顯著增加,細胞sod活力顯著降低,mda含量顯著增加。與h2o2組相比,pre組細胞增殖和遷移能力顯著提高,s期比例變化差異不顯著,細胞衰老和凋亡比例顯著降低,細胞sod活力顯著增加,mda含量顯著降低。2、體內(nèi)實驗鑒定獲得app+轉(zhuǎn)基因模型鼠40只。移植一周后,與huc-mscs組相比,聯(lián)合組腦組織遷移的干細胞數(shù)目顯著增加。移植兩周后,與app+組和huc-mscs組相比,mg53組和聯(lián)合組小鼠的運動能力均有顯著提高。移植四周后,與app+組相比,各處理組小鼠逃避潛伏期時間縮短、穿越平臺次數(shù)增多、平臺所在象限停留時間增加,sod活性增加,mda含量下降,腦組織中sirt1、Sirt2、PCNA基因的mRNA和蛋白表達增加,而P16、P21、P53基因的mRNA和蛋白表達降低,差異顯著;hUC-MSCs組和聯(lián)合組小鼠腦組織DCX和Nestin的表達增多,NSE表達變化差異不顯著。與hUC-MSCs組相比,聯(lián)合組小鼠逃避潛伏期時間顯著縮短,血清中SOD活性顯著增加而MDA含量顯著下降,腦組織中Sirt1、Sirt2、PCNA基因的mRNA和蛋白表達增加,而P16、P21、P53基因的mRNA和蛋白表達降低。結(jié)論1、rhMG53蛋白能夠提高hUC-MSCs的存活和遷移,rhMG53預(yù)處理能夠提高hUC-MSCs的抗氧化能力,減低H2O2對細胞造成的氧化損傷。2、外源rhMG53蛋白可以增加小鼠體內(nèi)hUC-MSCs的存活和遷移數(shù)目,改善APP+鼠的學習和認知能力,促進神經(jīng)細胞的增殖,對hUC-MSCs移植治療阿爾茨海默鼠有促進作用。
[Abstract]:Alzheimer's disease (Alzheimer disease AD) is a neurodegenerative disease closely related with age, with the aging of our society, AD patients increased year by year. At present, the improvement of the pathogenesis of AD and elucidate the treatment is still a difficult problem in medicine, stem cell transplantation in the treatment of as new therapies that brings hope for the treatment of AD. To improve the transplantation of stem cell viability, promote more stem cells migrate to the brain play a role, plays an important role in the.MG53 protein to improve the therapeutic effects of stem cell transplantation (Mitsugumin53 protein) is a newly discovered TRIM family of muscle specific protein, plays a key role in cell membrane damage repair and a variety of acute organ injury. But the protection of recombinant human MG53 (recombinant human Mitsugumin53 protein, rhMG53) of human umbilical cord mesenchymal stem cells (Human Umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs) reported protective effect of chronic pathological oxidative damage and AD. The protective effect of in vitro objective to establish the hUC-MSCs model of rhMG53 H2O2 oxidative damage on hUC-MSCs oxidative damage. In vivo experimental study of rhMG53 combined with hUC-MSCs transplantation on APP+ transgenic mice of intervention and treatment, in order to further understand the MG53 the function of hUC-MSCs protein and explore the protective and therapeutic effect on AD to provide a scientific basis. 1 methods, the protective effect of in vitro rhMG53 on oxidative hUC-MSCs damage using tissue culture method for isolation of hUC-MSCs from healthy human umbilical cord P3 cells to establish H2O2 damage model; influence of CCK-8 method for detection of rhMG53 protein on cell proliferation. Select the appropriate processing conditions, determine the experimental group as NC group, rhMG53 group, H2O2 group, rhMG53 pretreatment group (Pre group); Transwell Room to observe the effect of rhMG53 protein on cell migration; the effect of rhMG53 protein by flow cytometry on cell cycle and apoptosis; beta galactosidase staining of rhMG53 protein was detected on cell senescence; rhmg53 protein was detected by spectrophotometry effect on cell SOD activity and MDA content of.2, therapeutic effect in vivo rhmg53 combined with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer's mice using April old app+ transgenic rat model of Alzheimer's disease, divided into app+ group, hUC-MSCs group, rhmg53 group, rhmg53 combined with hUC-MSCs group (combined group); a week later, immunohistochemical detection of migration in the brain of mice hUC-MSCs transplantation rate; after two weeks, with the treadmill exercise capacity test mice; after four weeks, the ability of learning and memory in Morris water maze test in mice; Spectrophotometry Determination of serum SOD activity of mice and MDA; qRT-PCR and Westernblot to detect the The aging of brain tissue in mice related genes (SIRT1, sirt2, PCNA, p16, p21, p53) expression; immunohistochemistry in brain tissue of mice neural markers (DCX, nestin, NSE). Results the expression of P3 1, in vitro experiments found that the generation of hUC-MSCs adherent, spindle type, spiral shape, smooth surface, clear outline; after H2O2 treatment, cell adhesion ability decreased, cell wall width, surface damage blistery projections with.H2o2 concentration and time dependence on the hUC-MSCs, considering the cell proliferation ability and mortality, with 200 mh2o2 16h as oxidative damage model of the suitable conditions of.Rhmg53 on the proliferation of cells with a concentration dependent enhancement, using 30 g/mlrhmg53 as the experimental concentration. Compared with the NC group, the proliferation and migration of cells in rhmg53 group increased significantly, the proportion of s had no difference, cell senescence and apoptosis ratio Patients decreased significantly, the activity of SOD cells was significantly increased, MDA content decreased significantly; the proliferation of H2O2 cells, and the migration ability of cells in S phase decreased, the proportion of cell senescence and apoptosis cells significantly increased the activity of SOD decreased, MDA content increased significantly. Compared with the H2O2 group, the proliferation and migration of cells in pre group increased significantly. Changes in the proportion of S phase difference is not significant, the proportion of cell senescence and apoptosis of cells was significantly decreased, SOD activity increased significantly, MDA decreased the content of.2 in vivo identification of app+ transgenic mice was 40. One week after transplantation, compared with hUC-MSCs group, the number of stem cells in brain tissue of group migration increased significantly. After two weeks when compared with app+ group and hUC-MSCs group, mg53 group and combined group mice exercise capacity were significantly increased. Four weeks after transplantation, compared with app+ group, each group of mice escape latency time, cross platform The number increased, the platform quadrant dwell time increased, SOD activity increased, MDA decreased, SIRT1, Sirt2 in brain tissue, the expression of mRNA and protein of PCNA gene increased, while P16, P21, mRNA and protein expression of P53 gene decreased significantly; the increased expression of hUC-MSCs group and combined group mice brain tissue DCX and Nestin, NSE expression was not significantly different. Compared with the hUC-MSCs group, combined group mice escape latency was significantly shortened, the activity of serum SOD was significantly increased and MDA content decreased, Sirt1, Sirt2 in brain tissue, increase the expression of PCNA gene and mRNA protein and P16, P21, mRNA and protein expression of P53 gene reduced. Conclusion 1, rhMG53 protein can improve the survival and migration of hUC-MSCs, rhMG53 pretreatment can improve the oxidation resistance of hUC-MSCs,.2 decreased H2O2 on cell oxidative damage caused by the exogenous rhMG53 protein can increase the hUC-MSCs in mice The number of survival and migration, improve the learning and cognitive ability of APP+ rats, promote the proliferation of nerve cells, and promote the treatment of Alzheimer's rats by hUC-MSCs transplantation.

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16

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