本文關(guān)鍵詞：對阿爾茨海默病有抑制作用的中藥成分篩選和相關(guān)機制研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：大量研究表明,Aβ聚集形成老年斑是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。Ap是由p淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過p-分泌酶和γ-分泌酶剪切產(chǎn)生的含有39-42個氨基酸的多肽。APP的裂解有兩種途徑：(1)非淀粉樣途徑,由α、γ-分泌酶參與,裂解位點在Aβ之間,此途徑不產(chǎn)生Aβ；(2)淀粉樣途徑：由p、γ-分泌酶參與,此途徑形成Aβ,進而聚集形成老年斑。實驗顯示,Aβ集聚和纖維斑塊的形成對腦內(nèi)神經(jīng)細胞有很強的毒性作用,可引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),形成離子通道,破壞細胞內(nèi)外離子平衡,降低神經(jīng)細胞膜兩側(cè)的跨膜電位,損傷膽堿神經(jīng)系統(tǒng)、影響膽堿能神經(jīng)信號傳遞,誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡等,最終導(dǎo)致癡呆的發(fā)生。因此,通過降低β、γ-分泌酶活性、提高α-分泌酶活性來有效抑制Aβ的產(chǎn)生,可能對阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展具有潛在抑制作用。 中藥資源在我國有著悠久的治療疾病歷史。研究表明,有些中藥成分能夠改善動物模型的認知和記憶能力。本實驗室現(xiàn)有2種雙基因轉(zhuǎn)染細胞模型(能過表達Aβ和p-分泌酶的細胞模型及能過表達Ap和γ-分泌酶的細胞模型),能夠自然模擬Aβ和β、γ-分泌酶的過表達；有2種轉(zhuǎn)基因動物模型(APP轉(zhuǎn)基因模型鼠：又稱J20鼠,APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型鼠：又稱5XFAD鼠),能夠自然模擬AD的病理學(xué)特征,并且發(fā)病早,病理學(xué)特征比較明顯。本課題首先從現(xiàn)有文獻中選出10種具有改善AD動物模型記憶和認知能力的中藥成分,分別利用2種雙基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型對其抑制Aβ效果和相關(guān)機制進行探討,然后用2種轉(zhuǎn)基因動物模型對其藥效學(xué)進行驗證。 本課題的研究內(nèi)容主要包括二個部分：(1)篩選對體外過表達Ap有抑制作用的中藥成分及機制探討,(2)2種中藥成分對2種轉(zhuǎn)基因AD模型鼠的體內(nèi)藥效學(xué)觀察 第一部分：篩選對體外過表達Aβ有抑制作用的中藥成分及機制探討 目的：篩選對雙基因轉(zhuǎn)染細胞模型過表達p-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,簡稱：Aβ)有抑制作用的中藥成分,并探討其可能機制。 方法：從資料中選出10種具有潛在改善AD癥狀的中藥成分,分別以不同藥物濃度(0.5-100μmol·L-1)作用于兩種雙基因轉(zhuǎn)染細胞模型(117細胞模型：過表達Aβ和β-分泌酶；146細胞模型：過表達Aβ和γ-分泌酶),24-48h后,ELISA法測定各組細胞外Ap水平,初篩出具有降低細胞外Ap的中藥成分,并估算其最佳的作用濃度范圍,然后在其最佳濃度范圍內(nèi),設(shè)定濃度梯度,作用于兩種細胞模型,分別觀察其對細胞形態(tài)、活力及凋亡率的影響,并分析其對模型細胞內(nèi)Ap水平、p、γ-分泌酶活性的作用效果。 結(jié)果：1、經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)10種中藥成分中有4種能夠明顯抑制兩細胞模型內(nèi)、外Ap水平,且對細胞內(nèi)Ap的最高抑制率大于細胞外。 2、這4種中藥成分分別為：隱丹參酮、黃芪總皂苷、芍藥苷和天麻素。它們對117細胞內(nèi)Aβ的最高抑制率依次為：82.0%、75.9%、75.2%、73.8%,細胞外的最高抑制率依次為：76.5%、73.6%、72.6%、68.9%,對146細胞內(nèi)的Aβ最高抑制率依次為：88.1%、70.3%、74.4%、82.0%,細胞外的Ap最高抑制率依次為：84.2%、67.1%、72.4%、75.4%。 3、進一步的研究表明,黃芪總皂苷對β-分泌酶的活性有明顯抑制作用,最高抑制率為78.2%,未見對γ-分泌酶的影響；天麻素對γ-分泌酶活性有明顯抑制作用,最高抑制率為80.3%,未見對p-分泌酶的影響。隱丹參酮和芍藥苷對β、γ-分泌酶未見有影響。 4、細胞形態(tài)學(xué)、MTT和凋亡實驗證實了上述的中藥成分抑制Aβ、β-分泌酶和γ-分泌酶的作用是在不影響細胞活性下實現(xiàn)的。 小結(jié)：1、隱丹參酮、黃芪總皂苷、天麻素和芍藥苷能夠顯著抑制117和146細胞模型內(nèi)外Aβ的水平,這種抑制作用具有濃度依賴性。 2、黃芪總皂苷抑制Aβ的作用機制可能與其抑制了p-分泌酶的活性有關(guān),天麻素抑制Ap的作用機制可能與其抑制了Y-分泌酶的活性有關(guān)。隱丹參酮和芍藥苷對Aβ的機制有待進一步探討。 第二部分：2種中藥成分對2種轉(zhuǎn)基因AD模型鼠的體內(nèi)藥效學(xué)觀察 目的：研究第一部分中篩出的分別具有抑制p、γ-分泌酶活性成分(黃芪總皂苷(AST)和天麻素(GAS))對AD模型鼠行為學(xué)改善和腦內(nèi)Aβ斑塊的抑制效果。 方法：分別選用5XFAD鼠和J20鼠進行實驗。1、5XFAD鼠實驗方法,選用56只2月齡APP/PS1雙基因陽性小鼠,隨機分為7組,每組8只,另取同窩陰性小鼠8只作為正常對照。(1)陽性對照組(Tg)：每天飲用等量生理鹽水；(2)陰性對照組(Control):每天飲用等量生理鹽水；(3)黃芪總皂苷高劑量組(AST-H):每天飲用濃度為2mg/mL的黃芪總皂苷溶液;(4)黃芪總皂苷中劑量組(AST-M):每天飲用濃度為lmg/mL的黃芪總皂苷溶液；(5)黃芪總皂苷低劑量組(AST-L):每天飲用濃度為0.5mg/mL的黃芪總皂苷溶液;(6)天麻素高劑量組(GAS-H):每天飲用濃度為5mg/mL的天麻素溶液；(7)天麻素中劑量組(GAS-M):每天飲用濃度為2.5mg/mL的天麻素溶液；(8)天麻素低劑量組(GAS-L):每天飲用濃度為1.25mg/mL的天麻素溶液。2、J20鼠實驗方法,選用35只3月齡的小鼠,隨機分為7組,每組5只,另取同窩陰性小鼠5只作為正常對照,分組與給藥方法同5XFAD鼠。給藥3個月后,用Morris水迷宮測試模型鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力變化,ELISA雙抗體夾心法檢測模型鼠腦組織勻漿液中Ap水平,免疫組化染色法觀察模型鼠腦切片Aβ斑塊變化并進行定量分析。 結(jié)果：1、水迷宮結(jié)果：1)、隱性平臺尋找實驗結(jié)果,小鼠尋找隱性平臺所用時間越短,代表其學(xué)習(xí)認知越好。5XFAD和J20模型鼠的AST和GAS各組尋找隱性平臺的時間與Tg組相比,均明顯縮短；訓(xùn)練5天后,與Tg組相比,5XFAD模型鼠的AST-H和GAS-H組分別縮短了49.91%和50.60%(P0.01),AST-M和GAS-M組分別縮短了33.11%和38.63%(P0.05)；J20模型鼠的AST-H和GAS-H組分別縮短了49.01%和50.36%(P0.01),AST-M和GAS-M組分別縮短了39.88%和40.60%(P0.05)。2)、空間探索實驗結(jié)果,小鼠在目標象限逗留時間越長,表明其空間記憶能力和空間定位的準確性越好。與Tg組相比,5XFAD和J20模型鼠的AST和GAS各組在目標象限逗留時間明顯延長：其中,5XFAD模型鼠的AST-H和GAS-H組分別為Tg組的2.40和2.46倍(P0.01),AST-M和GAS-M組分別為Tg組的1.59和1.74倍；J20模型鼠的AST-H和GAS-H組分別為Tg組的2.03和2.31倍(P0.01),AST-M和GAS-M組分別為Tg組的1.84和2.08倍(P0.05)。 2、模型鼠腦勻漿Aβ水平檢測結(jié)果：ELISA結(jié)果顯示：與Tg組的腦勻漿中Aβ的平均OD值相比,AST和GAS各組均有不同程度降低。其中,5XFAD鼠AST-H(1.15)和GAS-H(1.04)組與Tg組(2.35)相比,分別下降了51.06%和55.74%；J20鼠AST-H(1.18)和GAS-H組(1.07)與Tg組(2.49)相比分別下降了52.61%和57.03%(P0.01)。 3、免疫組織化學(xué)結(jié)果：1)、光學(xué)顯微鏡下顯示,J20和5XFAD鼠的Tg組腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)區(qū)可見明顯的大小不一、棕黃色的Ap斑塊沉積,呈彌漫分布。AST和GAS各組與Tg組相比,腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)區(qū)Ap斑塊呈散在分布,斑塊體積和數(shù)目顯著減少、染色變淺。2)、IPP軟件定量分析表明,海馬區(qū)的Aβ陽性面積與Tg組相比,5XFAD鼠的AST-H和GAS-H組分別減少了91.46%和93.28%,J20鼠的AST-H和GAS-H組分別減少了90.27%和93.84%(P0.01)。皮質(zhì)區(qū)的Aβ陽性面積與Tg組相比,5XFAD鼠的AST-H和GAS-H組分別減少了84.94%和88.88%,J20鼠的AST-H和GAS-H組分別減少了87.99%和91.72%(P0.01)。 小結(jié)：1、AST和GAS能使5XFAD和J20鼠的尋找平臺時間縮短；在目標象限停留時間延長；顯著改善了2種轉(zhuǎn)基因模型鼠的空間學(xué)習(xí)認知記憶和定位能力,并且這種改善效果呈濃度依賴性。 2、AST和GAS明顯降低了5XFAD和J20鼠腦勻漿內(nèi)Ap水平,有抑制Ap產(chǎn)生的作用。 3、AST和GAS顯著抑制了5XFAD和J20鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)Ap的聚集和斑塊的形成。這可能與AST抑制了p-分泌酶的活性,GAS抑制了γ-分泌酶的活性,阻斷了Ap過度產(chǎn)生有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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本文編號：1318278