本文關鍵詞：氯化鋰聯(lián)合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的干預作用

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種與年齡直接相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其病因及發(fā)病的分子機制目前還不完全清楚,目前的治療方法只能改善癥狀,延緩病情進展。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)為AD的治療提供了新的思路。有效激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞和采用外源性干細胞移植以替代和修復受損的神經(jīng)元是治療AD的兩大策略。但干細胞在體內(nèi)生長和體外培養(yǎng)的過程中都會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象,進而導致衰老相關疾病的發(fā)生和干細胞的應用受限。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎生長發(fā)育中起著至關重要的作用。報道顯示激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進干細胞向神經(jīng)細胞分化,調(diào)節(jié)體內(nèi)海馬部位的神經(jīng)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞對阿爾茨海默鼠海馬神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)分化的促進作用可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。氯化鋰(lithium chloride,Li Cl)作為治療雙相性情感障礙最重要的藥物,應用于臨床已有100余年的歷史,其安全性和有效性已得到有效證實。同時,Li Cl是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的直接抑制劑,可以使β-catenin在細胞核內(nèi)聚集,從而激活Wnt/β-catenin通路。研究發(fā)現(xiàn)Li Cl可以改善阿爾茨海默鼠的空間記憶能力和神經(jīng)退行性病變。而Li Cl聯(lián)合干細胞對阿爾茨海默病的治療作用目前尚未見報道。目的因此,本課題以Li Cl為靶點,以人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)為對象,體外觀察Li Cl對h UC-MSCs增殖、衰老、凋亡以及神經(jīng)分化能力的影響,然后通過體內(nèi)實驗評價Li Cl聯(lián)合h UC-MSCs對AD鼠的神經(jīng)修復和干預作用,并初步探討其可能的分子機制,以期提高干細胞對AD的治療效果,為AD的治療提供理論依據(jù)。方法1、體外實驗研究Li Cl對h UC-MSCs增殖、衰老和神經(jīng)分化的影響實驗分為2組:對照組(MSCs組)和Li Cl處理組(MSCs+Li Cl組)。CCK-8實驗和Ed U染色法檢測Li Cl對h UC-MSCs增殖的影響;流式細胞術檢測Li Cl對h UC-MSCs周期和凋亡的影響;β-半乳糖苷酶染色法檢測Li Cl對h UC-MSCs衰老的影響;q RT-PCR和Western Blot檢測Li Cl對h UC-MSCs中衰老相關基因在m RNA和蛋白水平表達的影響;細胞免疫熒光法檢測神經(jīng)誘導分化后NSE、DCX、β-III Tubulin的表達情況;q RT-PCR檢測神經(jīng)誘導分化后Ngn1、Ngn2、Mash1的表達情況。2、體內(nèi)實驗分析Li Cl聯(lián)合h UC-MSCs移植對AD鼠的干預作用取60只4月齡AD模型鼠(APP695v717轉(zhuǎn)基因小鼠),分為6組:對照組(APP-組),AD模型組(APP+組)、Li Cl腹腔注射組(Li Cl組)、h UC-MSCs移植組(MSCs組)、Li Cl預處理h UC-MSCs移植組(Li Cl預組)Li Cl聯(lián)合h UC-MSCs移植組(Li Cl+MSCs組)。Morris水迷宮法檢測小鼠的學習記憶能力;取出小鼠腦組織做石蠟切片,免疫組化檢測腦內(nèi)h UC-MSCs的存活和遷移,分析腦內(nèi)神經(jīng)元標記物β-III Tubulin的表達,以及磷酸化tau蛋白的變化情況;分離小鼠海馬組織,q RT-PCR、Western Blot檢測海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關基因以及衰老相關基因的表達情況,q RT-PCR檢測海馬組織內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT3的表達變化。結果1、與對照組相比,Li Cl處理可以明顯促進h UC-MSCs的增殖,增加處于S期的細胞比例、降低凋亡細胞比率和β-半乳糖苷酶陽性細胞比例(P0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn)Li Cl可以降低h UC-MSCs中GSK-3β、p16、p21和p53在m RNA和蛋白水平的表達,增加c-Myc、p CNA、sirt1和sirt2在m RNA和蛋白水平的表達,而僅僅增加β-catenin蛋白的表達(P均0.05)。與h UC-MSCs相比,神經(jīng)誘導分化后細胞胞體明顯回縮,多數(shù)細胞可見樹突及軸突長出;誘導分化組中NSE、DCX、β-III Tubulin、Ngn2、Mash1的表達明顯增加(P0.05),而與單純誘導組相比,Li Cl處理組的各評價指標均有增加(P0.05)。2、與APP+組相比,h UC-MSCs移植和Li Cl腹腔注射均能明顯改善小鼠的學習記憶功能,二者聯(lián)合時效果更佳(P0.05)。與MSCs組相比,Li Cl+MSCs組海馬內(nèi)h UC-MSCs的存活明顯增加(P0.05)。各治療組海馬組織中衰老相關基因p16、p21、p53在m RNA和蛋白水平的表達均明顯下降,p CNA、sirt1、sirt2在m RNA和蛋白水平的表達明顯增加;其中,聯(lián)合治療組sirt1在m RNA和蛋白水平表達明顯高于單一治療組(P0.05)。各治療組Wnt/β-catenin信號通路相關基因GSK-3β均有下降、β-catenin、c-Myc均有升高,且c-Myc在聯(lián)合治療組升高更加明顯(P0.05)。各治療組β-III Tubulin、BDNF、NGF、NT3的表達均明顯增加(P0.05),其中聯(lián)合治療組增加最為明顯(P0.05)。結論1、Li Cl可通過激活Wnt/β-catenin信號通路和調(diào)控h UC-MSCs中衰老相關基因的表達促進h UC-MSCs的增殖,抑制h UC-MSCs的凋亡與衰老,促進h UC-MSCs的神經(jīng)分化,進而增加干細胞的活性。2、Li Cl通過增加h UC-MSCs的遷移存活和在損傷部位的神經(jīng)分化能力,明顯改善h UC-MSCs移植后AD鼠的學習和記憶能力,提高海馬內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達,進而延緩AD鼠的衰老。且Li Cl與h UC-MSCs聯(lián)合治療的效果明顯優(yōu)于單一治療的效果。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16

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1 劉海英,張慶俊,趙宗茂;人臍血干細胞的特性及其神經(jīng)分化的研究進展[J];河北醫(yī)藥;2004年02期

2 王翠琴;張廣宇;彭越;彭濤;賈延R，

本文編號：1303156