發(fā)布時間：2017-12-05 07:39

  本文關鍵詞：PKA-CREB抑制tau蛋白的表達

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【摘要】：目的阿爾茨海默病(AD),又稱老年性癡呆,是一種中樞神經系統(tǒng)退行性疾病,該病常見于老年人。異常過度磷酸化的tau蛋白是阿爾茨海默病患者腦中神經元纖維纏結(NFTs)的主要組成成分,并且患者癡呆程度與神經元纖維纏結的數量呈明顯的正相關,在神經退行性疾病中tau蛋白的病理性聚集是其主要特征之一。cAMP反應元件結合蛋白(CREB)是一種主要的轉錄調控因子,在神經元保護轉錄系統(tǒng)中起到至關重要的作用。根據本課題組之前的研究結果發(fā)現,與正常人的大腦相比,AD患者腦中總tau含量是上升的,CREB含量和活性是下降的,又因為CREB是一種重要的轉錄調控因子并且在AD患者腦中PKA-CREB信號通路有所下調,所以本課題主要旨在分子水平、細胞水平,動物水平來探討CREB是否會影響tau蛋白的轉錄以及如何影響tau蛋白的轉錄。方法(1)用不同濃度的forskolin側腦室注射兩個月齡的ICR小鼠,腦勻漿Western blots和qPCR分析tau蛋白和tau mRNA的變化。(2)取兩月齡的ICR小鼠神經元原代細施進行照代培養(yǎng),罔不周濃度的forskolin處理,之后做Western blots 和 qPCR分析TAU蛋白和tau mRNA的變化；用PCI-neo/CREB轉染SH-SY5Y細胞,之后做Western blots和RT-PCR分析tau蛋白和tau mRNA的變化。(3)依據軟件分析,把Tau啟動子區(qū)、點突變和缺失突變構建到含luciferase報告基因載體pGL3-basic中,利用雙報告基因檢測系統(tǒng),研究CREB對tau基因的表達調控作用：通過凝膠阻滯實驗(Electrophoretic mobility shift assay, EMS A)和染色缽免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)實驗,分別住胞外和胞內證實tau肩動了區(qū)CRE與CREB之間的特異性結合。結果(1)forskolin側腦室注射后,tau的蛋白水平和mRNA水平均F降。(2)forskolin處理神經元冗代細胞,tau的蛋白水平和mRNA水平均下降：用PCI-neo/CREB轉染SY5Y細胞,tau的蛋白水平和mRNA水平均下降。(3)MatInspector軟件分析發(fā)現Tau啟動子區(qū)含三個cAMP反應元件,分別命軹為CRE-1、CRE-2和CRE-3, CREB過表達可明顯地抑制tau啟動子驅動的螢光素酶的表達：凝膠阻滯實驗和染色體免疫共沉淀證明CREB可以特異性地結合于Tau啟動子區(qū)的CRE1和CRE3元件;tau啟動子區(qū)的各敲擊除突變體和點突變表明在CREB抑制tau蛋白基因的轉錄中CRE1起到主要作用。結論(1)CREB主要結合在tau promotor區(qū)的CRE1和CRE3元件,而不是CRE2元件。(2)在CREB抑制tau蛋白基因的轉錄中CRE1起到主要作用。(3) CREB可通過PKA信號通路被活化進而從轉錄水平來抑制Tau蛋白的表達。
【學位授予單位】：南通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16

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本文編號：1254046