發(fā)布時間：2017-11-25 06:14

  本文關(guān)鍵詞：硒酵母對AD小鼠腦內(nèi)自噬及其對Aβ、Tau清除作用的影響

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【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種多發(fā)病于老年期的神經(jīng)退行性疾病。大腦中的淀粉樣蛋白Aβ形成的斑塊沉積(SP)和過度磷酸化Tau蛋白聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)被公認(rèn)為是AD的主要病理特征。目前認(rèn)為Aβ和Tau等病理蛋白在腦內(nèi)蓄積,得不到有效清除可能是造成AD的誘因之一。自噬能降解胞內(nèi)變性蛋白及受損細胞器,從而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,它是清除Aβ和過度磷酸化的Tau蛋白的主要途徑之一,而自噬通路障礙也被認(rèn)為是引發(fā)AD的主要原因之一。因此對自噬過程的調(diào)控可能會為AD的治療提供新的靶點和方向。硒酵母是富含有機硒的酵母,其內(nèi)硒元素有70%以硒代蛋氨酸(Se-Met)的形式存在。本實驗采用三轉(zhuǎn)基因(Psen1、APPSwe、tauP301L)(3×Tg)AD小鼠從體內(nèi)探索硒酵母對AD的治療效應(yīng)及通過調(diào)控自噬對Aβ、Tau等蛋白的清除作用;同時采用3×Tg原代神經(jīng)元和N2a-APP695-SW細胞體外實驗探究Se-Met對AD的治療效應(yīng)及自噬調(diào)控機制,為特異性治療AD的藥物研究提供科學(xué)依據(jù)。方法:1)體內(nèi)實驗:硒酵母以5.18g/Kg濃度加入4月齡的3×Tg AD小鼠飼料中,持續(xù)給藥四個月后,采用Morris水迷宮和電跳臺實驗檢測AD小鼠認(rèn)知功能;原子熒光法檢測小鼠腦內(nèi)及內(nèi)臟器官硒含量;特異性試劑盒檢測腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平(SOD)、脂質(zhì)過氧化水平(MDA)及硒酶活性(Trx R、GPx);免疫熒光和Western-blot法檢測以下蛋白水平的變化:Aβ、APP、BACE-1、Tau、自噬相關(guān)蛋白(LC3、P62)、自噬通路蛋白(Akt、mTOR、p70S6K、AMPK)、組織蛋白酶D(Cat-D),并通過不連續(xù)密度梯度法分離腦組織中自噬體、自噬溶酶體及溶酶體后,檢測各組份中Aβ、Tau及磷酸化tau的含量。2)體外實驗:分離培養(yǎng)新生鼠[野生型(WT)、3×Tg]皮層原代神經(jīng)元,1μmol/L Se-Met處理24h后,用免疫熒光、Western-blot檢測以下幾方面變化:Aβ、APP、BACE-1、Tau、LC3、P62、Akt、mTOR、p70S6K、AMPK、Cat-D;N2a-APP695-sw細胞經(jīng)相同濃度的Se-Met作用24h后,檢測其Aβ、APP、BACE-1、β-CTF、LC3、P62、Akt、mTOR、p70S6K、AMPK、Cat-D水平變化,并且通過熒光探針mTagRFP-mWasabi-LC3轉(zhuǎn)染法,監(jiān)測細胞內(nèi)自噬流的變化。結(jié)果:1)體內(nèi)實驗:硒酵母給藥4個月后,在水迷宮實驗中,3×Tg AD小鼠逃避潛伏期比對照組整體顯著下降(++p0.01);同時其24h后原平臺象限停留時間和跨越平臺次數(shù)較對照組均顯著升高(**p0.01,*p0.05)。電跳臺實驗中,硒酵母組小鼠在d3訓(xùn)練和24h記憶中的錯誤次數(shù)較對照組顯著下降(*p0.05),在24h記憶中其平均潛伏期也相對更長。ad小鼠腦內(nèi)各部分及肝、脾、腎、血清等的硒含量較野生型小鼠均顯著下降(*p0.05),補充硒酵母后其硒含量又得到了顯著恢復(fù)(**p0.01,*p0.05);硒酵母治療后,小鼠腦內(nèi)app、aβ寡聚體、bace-1水平顯著降低(**p0.01,*p0.05);海馬區(qū)的aβ1-42及tau蛋白水平均顯著降低(**p0.01,*p0.05);同時小鼠海馬及皮層中l(wèi)c3Ⅱ水平顯著性下降(**p0.01),并且海馬區(qū)lc3Ⅱ與tau蛋白的共定位顯著增多(*p0.05)。進一步檢測自噬通路蛋白發(fā)現(xiàn):ad小鼠海馬和皮層區(qū)akt、mtor、p70s6k及p-p70s6k都顯著升高(**p0.01,*p0.05),而ampk及p-ampk顯著性下降(**p0.01,*p0.05);自噬降解底物接頭分子p62水平顯著下降(**p0.01),而cat-d水平顯著性升高(*p0.05)。分析各自噬體組分發(fā)現(xiàn):tg組小鼠的自噬體中aβ、tau、tau-ps202、tau-ps422表達水平較wt組明顯增高,而硒酵母組中這些病理蛋白水平明顯下降;在自噬溶酶體中,tg組中這些病理蛋白水平較wt組是下降的,而硒酵母作用后水平明顯升高。試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)通過硒酵母治療后,ad小鼠腦組織各部分中sod水平有升高趨勢,而丙二醛含量顯著下降(**p0.01,*p0.05),trxr、gpx活性顯著性上升(**p0.01,*p0.05)。2)體外實驗:與wt原代神經(jīng)元相比,3×tg原代神經(jīng)元的app、aβ、bace-1蛋白水平均顯著性升高(##p0.01,###p0.001),而se-met作用后以上蛋白表達水平均顯著性下降(**p0.01,*p0.05,***p0.001)。自噬方面:3×tg原代神經(jīng)元較wt組lc3Ⅱ蛋白水平顯著上升(#p0.05),se-met作用后,lc3Ⅱ水平顯著下降(**p0.01),同時自噬體與tau蛋白的共定位明顯增多;se-met組較對照組其akt及其磷酸化p-akt蛋白水平顯著上升,而mtor、p70s6k及p-p70s6k水平均顯著下降(**p0.01,*p0.05);同時,p62水平顯著下降(*p0.05),cat-d水平顯著增高(*p0.05)。se-met作用后,n2a-app695-sw細胞內(nèi)aβ、app、bace-1、β-ctf水平均降低(**p0.01,*p0.05);lc3Ⅱ表達水平也顯著降低(*p0.05),自噬通路蛋白中:akt、mtor、p70s6k及p-p70s6k水平均顯著上升(**p0.01,*p0.05);p62、beclin1水平顯著下降(*p0.05);cat-d水平顯著上升(**p0.01);se-met作用也促進了細胞內(nèi)lc3與aβ共定位。mtagrfp-mwasabi-lc3轉(zhuǎn)染后,發(fā)現(xiàn)se-met能促進自噬體向自噬溶酶體的轉(zhuǎn)換。結(jié)論:綜上所述表明,硒酵母可以顯著性提高ad小鼠的記憶能力,降低腦內(nèi)app、aβ及tau蛋白水平,提高硒含量及硒酶活性,并加強腦內(nèi)抗氧化能力,體內(nèi)體外實驗都證明硒代蛋氨酸或硒酵母一方面可以通過抑制APP和/或BACE-1水平,從而減少Aβ的生成。另一方面通過調(diào)節(jié)自噬信號通路,調(diào)控自噬水平,并促進自噬體向自噬溶酶體的轉(zhuǎn)化,加強對Aβ、Tau等病理蛋白的清除。因此,硒酵母是一種在預(yù)防及治療AD方面很有潛力的藥物。
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16

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本文編號：1225049