本文關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病細胞模型中l(wèi)ncRNA RP11-543N12.1對CDH13表達的調(diào)控作用

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【摘要】：背景：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD),老年人群中最普遍的癡呆癥的起因,是一種漸進性和致命性的神經(jīng)退行性紊亂。該疾病是一個全球性難題,全世界患病人數(shù)達3000萬人,經(jīng)濟負擔(dān)超過5000億美元。流行病學(xué)研究表明,65歲以上人群中,約11%有患病特征,85歲以上的人群中,約1/3患有不同程度的老年癡呆癥�，F(xiàn)如今,在美國和歐洲,影響著大約1.06億人的生活,預(yù)計到2030年AD將達到流行病比例(1540萬)。阿爾茨海默病病理特征表現(xiàn)為海馬和大腦皮層中突觸和神經(jīng)元漸進性缺失,這與短期記憶減退和認知功能障礙相關(guān)。在分子水平上,AD的典型病理學(xué)標志為神經(jīng)細胞外不可溶性的β-淀粉樣蛋白(P-amyloid peptide, Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque, SP)和神經(jīng)細胞內(nèi)高度磷酸化的微管相關(guān)Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)。 AD是一個嚴重的公共健康挑戰(zhàn)。然而,對于AD患者來說,現(xiàn)有的治療手段是非常局限的,并且不能改善疾病的發(fā)展。因此,尋找新的治療靶標來應(yīng)對多樣的AD表型和相關(guān)的病理機制迫在眉睫。真核生物轉(zhuǎn)錄組的全基因組分析表明,接近90%的人類基因組發(fā)生轉(zhuǎn)錄,然而這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中僅1%-2%編碼蛋白質(zhì)(約20,000個蛋白編碼基因)�；蚪M中的大多數(shù),之前被認為是"junk DNA" or "transcriptional noise",大部分轉(zhuǎn)錄為非蛋白編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA)。依據(jù)轉(zhuǎn)錄長度,ncRNA被分為兩大類：小RNA和長鏈非編碼RNA。其中長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸并且沒有蛋白編碼能力,大部分由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄,通常有帽子,多聚腺苷酸尾和剪切的RNA分子。近年來研究表明,lncRNA相關(guān)的功能失調(diào)在各種疾病中發(fā)揮重要作用,且在神經(jīng)退行性疾病中的作用越來越明顯。例如,M.A. Faghihi等發(fā)現(xiàn)BACE1-antisense transcript(B ACE 1-AS)和BACE1 mRNA有廣泛的互補性,并能提高BACE1 mRNA的穩(wěn)定性,保護其不被mir-485-5p降解。BACE1蛋白水平和活性隨著大腦衰老的加劇而增加；在AD中,BACE1表達升高和BACE1-AS豐度上調(diào)相關(guān),表明BACE1-AS在AD發(fā)展過程中能夠發(fā)揮作用。S. Massone等研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-17A過表達能夠抑制GABABR2變體A,促進變體B的表達,并促進Aβ42和Aβ40的累積,而Aβ42和Aβ40源于淀粉樣蛋白前體(APP)并且與AD發(fā)病機制密切相關(guān),這些發(fā)現(xiàn)表明,lncRNA-17A可能在GABA信號傳導(dǎo)和Ap生成中發(fā)揮作用。E. Mus等發(fā)現(xiàn)在49-86歲人群中,BCYRN1在皮層區(qū)域表達下降60%以上,但是與同齡的正常大腦相比,在AD大腦中表達上調(diào)。雖然lncRNA研究取得了一定的進展,但是仍處于初期階段,lncRNA的特征、保守性、功能和作用機制仍需要進一步深入研究。隨著基因芯片技術(shù)的不斷進步,使得快速、高靈敏度檢測低豐度RNA分子的表達變化得以實現(xiàn)。我們課題組采用Arraystar LncRNA芯片技術(shù)對正常細胞和AD細胞模型中的lncRNA和mRNA分別進行了檢測,得到lncRNA和mRNA差異表達譜。結(jié)果顯示：與正常細胞相比,AD細胞模型中差異表達lncRNA 2650條,其中997條表達上調(diào),1653條表達下調(diào)；差異表達mRNA1209條,其中606條表達上調(diào),603條表達下調(diào)。接著我們采用熒光定量PCR選擇性驗證了9條lncRNAs,分別為RP11-642D21.2、ZBTB20-AS1、RP11-354P11.2、 RP11-543N-12.1、RP1-77H15.1、RP11-121G22.3、RP11-10O22.2、 RP11-414H23.3、RP11-79E3.2和5條mRNAs,分別為MAPT、PPFIA2、CDH13、 ZFPM2、ZBTB20,熒光定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致,經(jīng)過NCBI、lncRNA數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻分析,確定研究lncRNA RP11-543N12.1和CDH13表達的相關(guān)性。CDH13編碼T-鈣黏蛋白(又名H-鈣黏蛋白,心臟鈣黏蛋白),屬于鈣黏蛋白超級家族成員,是一種鈣-依賴細胞粘附分子,在不同組織中發(fā)揮著重要作用。CDH13位于人染色體16q24長臂,包含14個外顯子(其中2個非編碼)和一個富集CpG島的啟動子,并且顯示出高度甲基化,特別是在不同的癌癥中。CDH13是細胞黏附分子鈣黏蛋白家族中的非典型成員,不像其他經(jīng)典的鈣黏蛋白,它缺少跨膜區(qū),通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨附著在細胞膜上,粘附性低。T-鈣黏蛋白首先在雞腦中被發(fā)現(xiàn),后來人的CDH13通過PCR克隆得到。不同的研究表明,癌癥中CDH13在細胞增殖、細胞循環(huán)和表觀沉默中發(fā)揮作用,CDH13現(xiàn)已被公認為一種腫瘤抑制基因。CDH13在卵巢癌,乳腺癌,肺癌等腫瘤疾病中由于自身甲基化表達降低,被認為是不良預(yù)后強有力的預(yù)測。CDH13還能抑制神經(jīng)細胞的發(fā)育,通過調(diào)節(jié)P21誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞瘤G2期阻滯。但有關(guān)CDH13與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系還未見報道。本研究可能是首次在阿爾茨海默病細胞模型中發(fā)現(xiàn)CDH13表達上調(diào),并初步研究了lncRNARP11-543N12.1對CDH13表達的調(diào)控作用。研究目的：研究阿爾茨海默病細胞模型中長鏈非編碼RNARP11-543N12.1對CDH13表達的調(diào)控作用。實驗方法：1.構(gòu)建阿爾茨海默病細胞模型,采用基因芯片技術(shù)篩選阿爾茨海默病相關(guān)差異表達lncRNA和mRNA。2.Real-time PCR實驗選擇性驗證顯著差異表達的lncRNA和mRNA。3.構(gòu)建pcDNA3.1 (+)-RP 11-543N12.1表達載體,將其與RP11-543N12.1-siRNA分別轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細胞,轉(zhuǎn)染RP11-543N12.1-siRNA細胞分組為：MOCK組,MOCK+Aβ25-35組,NC組,NC+Aβ25-35組,RP11-543N12.1-siRNA, RP11-543-N12.1-siRNA+Ap25-35組；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細胞分組為：MOCK組,MOCK+Aβ25-35組,pcDNA3.1(+)組,pcDNA3.1(+)+Aβ25-35組,pcDNA3.1 (+)-RP11-543N12.1, pcDNA3.1(+)-RP11-543N12.1+Aβ25-35組；轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h,加入Aβ25-35(20μmol/L)作用48h。4.按照3中分組處理,Real-time PCR技術(shù)檢測RP11-543N12.1和CDH13在RNA水平的變化,MTT檢測細胞存活率,Western blotting檢測CDH13蛋白表達,Hoechst染色檢測細胞核的形態(tài)學(xué)變化,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。實驗結(jié)果：1.常規(guī)培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞加入Aβ25-35處理48h后,Western blotting實驗檢測總Tau及磷酸化蛋白(P-tau)表達升高(P0.01),表明阿爾茨海默病細胞模型構(gòu)建成功。通過基因芯片技術(shù)得到差異表達lncRNA2650條,其中997條表達上調(diào),1653條表達下調(diào)；差異表達mRNA1209條,其中606條表達上調(diào),603條表達下調(diào)。2.我們選擇性的驗證了9條lncRNAs和5條mRNAs,驗證結(jié)果與芯片一致,差異表達具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),并最終確定研究lncRNARP11-543N12.1與CDH13表達的相關(guān)性。3.在未轉(zhuǎn)染RP11-543N12.1-siRNA和pcDNA3.1 (+)-RP 11-543N 12.1的SH-SY5Y細胞中,Aβ25-35處理48h后,與正常細胞相比,細胞存活率降低(P0.05),CDH13 RNA表達升高(P0.01), CDH13蛋白活性形式表達增加(P0.01),細胞核出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化,流式檢測細胞凋亡率增加(P0.05)。轉(zhuǎn)入RP11-543-N12.1-siRNA后再用Aβ25-35處理48h,細胞存活率、CDH13 RNA水平、蛋白活性形式表達量、細胞凋亡率均趨于正常水平,細胞核凋亡的形態(tài)學(xué)變化消失；轉(zhuǎn)入pcDNA3.1(+)-RP11-543N12.1后再用Aβ25-35處理48h,細胞存活率明顯降低(P0.01), CDH13RNA表達量、蛋白活性形式表達量、細胞凋亡率均增加(P0.05)細胞核出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)論：LncRNARP11-543N12.1能夠調(diào)控CDH13的表達。降低RP11-543N12.1的表達量能使CDH13表達下調(diào),升高RP11-543N12.1的表達能使CDH13表達上調(diào),即lncRNARP11-543N12.1與CDH13的表達呈正相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 SH-SY5Y細胞 LncRNA RP11-543N12.1 CDH13 表達調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號說明15-17
• 前言17-27
• 材料與方法27-46
• 結(jié)果46-59
• 討論59-64
• 結(jié)論64
• 創(chuàng)新點64-65
• 參考文獻65-72
• 致謝72-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文73-74
• 附件74

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本文編號：1125477