本文關鍵詞：二硫鍵異構酶對甲基苯丙胺誘導的α-突觸核蛋白表達異常的機制研究

  更多相關文章： 甲基苯丙胺(METH) α-突觸核蛋白(α-SN) 氧化應激 二硫鍵異構酶(PDI) 神經毒性

【摘要】：研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH),又稱去氧麻黃堿,具有苯環(huán)結構,與兒茶酚胺類遞質結構極其相似,易溶于水及酒精,其鹽酸鹽為透明的結晶體,狀如冰,俗稱“冰毒”。METH作為一種新型毒品,由于其合成技術簡單、容易獲得等原因,已成為世界上流行最快、濫用最為廣泛的中樞興奮劑之一。同時METH的長期濫用可引起各類刑事犯罪,給社會的治安帶來極大危害。因此,對METH的毒性及其防治的研究已成為世界面臨的重大課題和研究熱點。本教研室關于METH神經毒性的前期研究中已經發(fā)現(xiàn),METH作用后a-突觸突觸核蛋白(a-synuclein, a-SN)在紋狀體等相關腦區(qū)表達升高,證實α-SN在METH所致的氧化應激、多巴胺(DA)代謝障礙和線粒體功能喪失等幾種神經毒性機制中都扮演了重要角色,并且是一個關鍵的毒性靶點。大量證據表明,a-SN的異常表達與帕金森病(Parkinson, PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer, AD)等神經退行性疾病的發(fā)病密切相關。影像醫(yī)學研究資料和流行病學資料表明,METH使用者患PD的比率明顯升高,METH可造成大腦額葉皮層、海馬以及紋狀體等腦區(qū)神經元的損傷,產生與AD以及PD相似的病理學改變。且已有文獻報道a-SN基因是PD的致病基因,在一些家族型PD患者中存在α-SN的突變,且不論是家族性還是散在性PD中,a-SN都是PD特征性包涵體Lewy小體的主要組成成分。尤其α-SN的錯義突變(A30P、A53T和E46K)和其核心序列(66VGGAVVTGV74)對PD起著至關重要的作用。α-SN在生理狀態(tài)下為可溶性天然非折疊狀態(tài),在調節(jié)突觸可塑性和遞質釋放等方面有重要的作用。在病理狀態(tài)下呈聚集狀態(tài),在一些神經退行性疾病中,α-SN的聚集物不僅能夠抑制DA合成限速酶酪氨酸羥化酶表達,還能促進細胞的氧化應激增強,對神經元產生毒性作用,同時氧化應激又是促進α-SN聚集的重要因素,從而造成惡性循環(huán),加劇神經退行性疾病的進展。因此深入研究METH誘導的α-SN聚集機制具有重要意義,將為METH導致的神經毒性或其他的一些神經退行性疾病提供重要靶點。二硫鍵異構酶(Protein disulfide isomerase, PDI)是一種內質網滯留蛋白,參與新合成的分泌性蛋白質的修飾和折疊,催化硫醇-二硫鍵交換反應,形成二硫鍵,而二硫鍵在穩(wěn)定蛋白質的三維結構中起著非常重要的作用。PDI有多個結構域,不僅能夠催化巰基-二硫鍵交換反應,促進蛋白二硫鍵的生成和錯配二硫鍵的重排,還具有氧化、還原和異構多種功能。此外,PDI同時還具有分子伴侶活性,能抑制錯誤折疊蛋白的聚集,穩(wěn)定蛋白質的正確結構。在多種神經變性疾病中,如帕金森癥、阿爾茲海默癥等,PDI可通過抑制錯誤折疊蛋白的聚集以及遍在蛋白化,起到神經保護作用。然而在一些退行性疾病中,PDI易與氧化應激產生的NO結合,而形成S亞硝基化PDI (PDI-SNO)。 PDI-SNO可導致PDI的構象發(fā)生改變,其原有的氧化、還原、異構以及分子伴侶等功能受損。早在2006年,Uehara等在nature已報道研究發(fā)現(xiàn)PDI及PDI-SNO在蛋白質異常聚集相關神經系統(tǒng)變性疾病中具有重要地位,在散發(fā)的PD和AD患者腦組織樣本中,PDI明顯被S-亞硝基化。我們在前期試驗中已發(fā)現(xiàn),METH處理后,體內外的氧化應激都明顯增強,NO生成明顯升高。然而,METH誘導的氧化應激對PDI的作用,以及PDI對異常表達的α-SN的作用機制研究還未見有報道,尚需要研究證實。本研究擬建立METH中毒細胞模型,通過形態(tài)學、NOS含量、NO含量、凋亡、α-SN聚集及PDI的S亞硝基化等指標的檢測,進一步驗證METH引起中樞神經毒性作用。再通過NOS抑制劑(L-NNA)和NO供體(L-Arginine)驗證氧化應激過程中PDI的變化,以及變化的PDI對異常表達的α-SN的影響,從而進一步完善METH誘導的a-SN異常表達的毒性機制,為治療METH引起的毒性損傷提供理論基礎。目的：建立METH中毒細胞模型,并給予NOS抑制劑和NO供體,通過形態(tài)學、NOS含量、NO含量、凋亡、a-SN聚集及PDI的S亞硝基化等指標的檢測,從而研究METH誘導的氧化應激對PDI正常功能的影響,以及PDI在a-SN異常表達中所起的作用。再通過siRNA干擾技術反證之前所得的結果,以進一步明確METH、PDI以及a-SN這三者之間的聯(lián)系,為METH神經毒性機制研究提供新的研究靶點。方法：1.METH中毒細胞模型的建立(1)10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基分別接種PC12細胞至96孔板中,在37℃和5%C02條件下培養(yǎng),待細胞長至70%匯合時,分別用含Ommol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/LMETH的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,CCK-8法檢測細胞存活率變化。(2)接種PC12細胞至10個6cm小皿中,待細胞長至70%匯合時,隨機分成兩組,其中一組的5個小皿用0.1mmol/L　L-NNA預處理30分鐘,處理之后,兩組的5個小皿的細胞分別用含Ommol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、 3mmol/LMETH的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,生物素轉化法和western Blot分別檢測各組細胞PDI-SNO表達變化,并綜合比較以選取適宜濃度的METH以建立中毒細胞模型。2.探究PDI對METH誘導的a-SN異常表達的作用機制接種PC12細胞至6孔板或96孔板或10cm培養(yǎng)皿中并將細胞分為6組：空白對照組(CON)、空白NOS抑制劑組(CON+L-NNA)、空白NO供體組(CON+L-Arginine)、給藥組(METH)、給藥NOS抑制劑組(METH+L-NNA)、給藥NO供體組(METH+L-Arginine),24小時后,收集細胞或細胞液進行以下各項實驗：(1)倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學損傷變化、CCK-8法觀察各組細胞存活率的表達變化。(2)TUNEL法和hoechst法檢測各組細胞凋亡情況。(3)酶化學法檢測NOS、NO的活性變化,Western B lot法檢測NOS表達情況。(4)生物素轉化法和Western Blot法檢測各組細胞PDI-SNO表達變化。(5)Western Blot法和免疫熒光法檢測a-SN表達變化,并采用共聚焦顯微鏡觀察細胞內a-SN形態(tài)變化。3.PDI基因沉默的PC12細胞在METH和L-NNA共同處理下細胞內a-SN的表達情況(1)針對PDI基因設計并合成三條siRNA干擾序列,采用RNA干擾技術(RNAi)處理PC12細胞,采用Western Blot法檢測出最有效的干擾序列。(2)采用最有效的干擾序列沉默PC12細胞的PDI表達后,用METH和L-NNA共同處理,采用Western Blot法和免疫熒光法檢測α-SN表達變化。結果：1.METH中毒細胞模型的建立(1)以未經METH處理的PC12細胞為對照組,0.5-3mmol/L METH處理的PC12細胞存活率隨METH濃度增加逐漸降低,除0.5mmol/L處理組與對照組相比無顯著性差異(p0.05)外,其他各濃度處理組與對照組相比均有顯著性差異(p0.05)。(2)相比于空白對照組,METH處理的PC12細胞PDI-SNO表達隨METH濃度增加逐漸增高,在METH濃度大于2mmol/L時,PDI-SNO升高與對照組相比均有顯著性差異(p0.05)。當加入NOS抑制劑L-NNA時,可顯著抑制METH引起的PDI-SNO表達升高,且當METH濃度為3 mmol/L時,抑制效果最為顯著(p0.01),故在后期試驗中,選取3mmol/L濃度的METH建立中毒細胞模型。2.探究PDI對METH誘導的a-SN異常表達的作用機制(1)六組細胞模型分別經過不同的處理24h后,倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化,可見CON+L-NNA組細胞形態(tài)與CON組相比無明顯變化,而CON+L-Arginine組和METH組細胞形態(tài)與CON組相比明顯改變,可見胞體皺縮變圓,變圓細胞的胞質透亮度增加可見環(huán)形透亮區(qū),且突起變短、斷裂、甚至消失,并可見細胞脫壁漂浮,METH+L-NNA組與METH組相比,細胞形態(tài)改變有明顯的改善,而METH+L-Arginine組與METH組相比,細胞形態(tài)改變更為顯著。CCK-8法測得CON+L-NNA組細胞存活率較CON組無明顯變化(P0.05), CON+L-Arginine組和METH組細胞存活率較CON組顯著下降(p0.05),METH+L-NNA組細胞存活率較METH組顯著升高(p0.05), METH+L-Arginine組細胞存活率較METH組顯著下降(p0.05)。(2)采用TUNEL法和hoechst法檢測6組細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)：CON+L-NNA組細胞凋亡較CON組無明顯變化(P0.05), CON+L-Arginine組和METH組細胞凋亡較CON組顯著下降(p0.05), METH+L-NNA組細胞凋亡較METH組顯著升高(p0.05), METH+L-Arginine組細胞凋亡較METH組顯著下降(p0.05)。(3)酶化學法檢測發(fā)現(xiàn)：CON+L-NNA組細胞內NOS和NO活性較CON組無明顯變化(P0.05),CON+L-Arginine組和METH組細胞內NOS和NO活性較CON組顯著升高(p0.05),METH+L-NNA組細胞內NOS和NO活性較METH組顯著降低(p0.05),METH+L-Arginine組細胞內NOS和NO活性較METH組顯著升高(p0.05)。且通過Western Blot法檢測細胞內NOS表達,結果與酶化學法檢測結果一致。(4)生物素轉化法和Western B lot法檢測各組細胞PDI-SNO表達發(fā)現(xiàn)：METH和L-Arginine可使PDI發(fā)生顯著的S亞硝基化,使得PDI-SNO表達顯著升高(p0.05),而L-NNA可有效抑制METH引起的PDI的S亞硝基化,L-Arginine則顯著加劇METH引起的PDI的S亞硝基化。(5)Western B lot法檢測各組細胞a-SN表達發(fā)現(xiàn)：CON+L-Arginine組和METH組細胞內a-SN相比于CON組顯著升高(p0.05),而METH+L-NNA組細胞內α-SN相比于METH組顯著降低(p0.05),METH+L-Arginine組細胞內a-SN相比于METH組顯著升高(p0.05)。在共聚焦顯微鏡下觀察可見：CON+L-Arginine組和METH組細胞內a-SN發(fā)生顯著聚集,L-NNA可有效抑制METH引起的a-SN的聚集,L-Arginine則顯著加劇METH引起的a-SN的聚集。3.PDI基因沉默的PC12細胞在METH和L-NNA共同處理下細胞內a-SN的表達情況(1)針對PDI基因設計并合成三條siRNA干擾序列,采用RNA干擾技術(RNAi)處理PC12細胞,采用Western Blot法檢測出最有效的干擾序列。結果顯示三條siRNA序列都能夠沉默PDI基因的表達,其中第二條序列沉默效果最好。(2)采用最有效的干擾序列沉默PC12細胞的PDI基因表達后,再用METH和L-NNA共同處理細胞24h,Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)PDI沉默后的PC12細胞在METH和L-NNA共同處理下,L-NNA無法有效的抑制METH引起的a-SN的異常表達,且在共聚焦顯微鏡下觀察的結果也與前者一致,a-SN的聚集無法得到顯著抑制。結論：1. PDI-SNO在METH處理的PC12細胞株中表達顯著上調,且上調趨勢隨METH濃度的增高而升高。NOS抑制劑L-NNA可有效抑制PDI-SNO的表達,且當METH的濃度為3mmol/L時,抑制效果最為顯著。2.METH可誘導細胞產生氧化應激及細胞內a-SN發(fā)生聚集,氧化應激使得PDI發(fā)生S亞硝基化而無法抑制α-SN的聚集,聚集的a-SN使得細胞毒性增強,促進細胞凋亡。NOS抑制劑L-NNA可有效抑制這一過程從而抑制METH的神經毒性,而NO供體L-Areinine則作用相反。說明氧化應激使得PDI功能異常,進而無法通過抑制a-SN的聚集起到神經保護作用。3.PDI基因沉默的PC12細胞即使加入NOS抑制劑L-NNA,也無法抑制METH導致a-SN的聚集。說明PDI是抑制a-SN聚集的關鍵分子。
【關鍵詞】：甲基苯丙胺(METH) α-突觸核蛋白(α-SN) 氧化應激 二硫鍵異構酶(PDI) 神經毒性
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.64
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-18
• 前言18-23
• 參考文獻19-23
• 第一章 METH中毒細胞模型的建立23-41
• 1 材料與方法23-34
• 1.1 材料和試劑23-28
• 1.2 方法28-34
• 2 結果34-36
• 2.1 不同濃度的METH處理,各組細胞存活率的變化34-35
• 2.2 L-NNA和不同濃度的METH共同處理,細胞內PDI-SNO表達情況35-36
• 3 討論36-38
• 4 參考文獻38-41
• 第二章 探究PDI對METH誘導的α-SN表達異常的作用機制41-69
• 1 材料與方法41-52
• 1.1 材料和試劑41-45
• 1.2 方法45-52
• 2 結果52-64
• 2.1 各組細胞形態(tài)學變化52-54
• 2.2 各組細胞存活率的變化54-55
• 2.3 各組細胞凋亡率的變化55-59
• 2.4 各組細胞NO含量變化59-60
• 2.5 各組細胞NOS活性變化60-61
• 2.6 各組細胞PDI-SNO含量變化61-62
• 2.7 各組細胞α-SN含量變化62-63
• 2.8 各組細胞α-SN形態(tài)變化63-64
• 3 討論64-66
• 4 參考文獻66-69
• 第三章 PDI基因沉默的PC12細胞在METH和L-NNA共同處理下細胞內α-SN的表達情況69-78
• 1 材料與方法69-72
• 1.1 材料和試劑69-70
• 1.2 方法70-72
• 2 結果72-75
• 2.1 質粒轉染結果72-73
• 2.2 PDI基因沉默后PC12細胞在METH和L-NNA共同處理下細胞內α-SN含量變化73-74
• 2.3 PDI基因沉默后PC12細胞在METH和L-NNA共同處理下細胞內α-SN形態(tài)變化74-75
• 3 討論75-76
• 4 參考文獻76-78
• 全文小結78-80
• 英文縮略詞注釋80-81
• 攻讀碩士學位期間成果81-82
• 致謝82-83

【共引文獻】

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本文編號：1000818