發(fā)布時(shí)間：2017-10-09 15:00

  本文關(guān)鍵詞：二硫鍵異構(gòu)酶對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白表達(dá)異常的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 甲基苯丙胺(METH) α-突觸核蛋白(α-SN) 氧化應(yīng)激 二硫鍵異構(gòu)酶(PDI) 神經(jīng)毒性

【摘要】：研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH),又稱去氧麻黃堿,具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),與兒茶酚胺類遞質(zhì)結(jié)構(gòu)極其相似,易溶于水及酒精,其鹽酸鹽為透明的結(jié)晶體,狀如冰,俗稱“冰毒”。METH作為一種新型毒品,由于其合成技術(shù)簡單、容易獲得等原因,已成為世界上流行最快、濫用最為廣泛的中樞興奮劑之一。同時(shí)METH的長期濫用可引起各類刑事犯罪,給社會(huì)的治安帶來極大危害。因此,對(duì)METH的毒性及其防治的研究已成為世界面臨的重大課題和研究熱點(diǎn)。本教研室關(guān)于METH神經(jīng)毒性的前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),METH作用后a-突觸突觸核蛋白(a-synuclein, a-SN)在紋狀體等相關(guān)腦區(qū)表達(dá)升高,證實(shí)α-SN在METH所致的氧化應(yīng)激、多巴胺(DA)代謝障礙和線粒體功能喪失等幾種神經(jīng)毒性機(jī)制中都扮演了重要角色,并且是一個(gè)關(guān)鍵的毒性靶點(diǎn)。大量證據(jù)表明,a-SN的異常表達(dá)與帕金森病(Parkinson, PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer, AD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。影像醫(yī)學(xué)研究資料和流行病學(xué)資料表明,METH使用者患PD的比率明顯升高,METH可造成大腦額葉皮層、海馬以及紋狀體等腦區(qū)神經(jīng)元的損傷,產(chǎn)生與AD以及PD相似的病理學(xué)改變。且已有文獻(xiàn)報(bào)道a-SN基因是PD的致病基因,在一些家族型PD患者中存在α-SN的突變,且不論是家族性還是散在性PD中,a-SN都是PD特征性包涵體Lewy小體的主要組成成分。尤其α-SN的錯(cuò)義突變(A30P、A53T和E46K)和其核心序列(66VGGAVVTGV74)對(duì)PD起著至關(guān)重要的作用。α-SN在生理狀態(tài)下為可溶性天然非折疊狀態(tài),在調(diào)節(jié)突觸可塑性和遞質(zhì)釋放等方面有重要的作用。在病理狀態(tài)下呈聚集狀態(tài),在一些神經(jīng)退行性疾病中,α-SN的聚集物不僅能夠抑制DA合成限速酶酪氨酸羥化酶表達(dá),還能促進(jìn)細(xì)胞的氧化應(yīng)激增強(qiáng),對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用,同時(shí)氧化應(yīng)激又是促進(jìn)α-SN聚集的重要因素,從而造成惡性循環(huán),加劇神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。因此深入研究METH誘導(dǎo)的α-SN聚集機(jī)制具有重要意義,將為METH導(dǎo)致的神經(jīng)毒性或其他的一些神經(jīng)退行性疾病提供重要靶點(diǎn)。二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase, PDI)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留蛋白,參與新合成的分泌性蛋白質(zhì)的修飾和折疊,催化硫醇-二硫鍵交換反應(yīng),形成二硫鍵,而二硫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著非常重要的作用。PDI有多個(gè)結(jié)構(gòu)域,不僅能夠催化巰基-二硫鍵交換反應(yīng),促進(jìn)蛋白二硫鍵的生成和錯(cuò)配二硫鍵的重排,還具有氧化、還原和異構(gòu)多種功能。此外,PDI同時(shí)還具有分子伴侶活性,能抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集,穩(wěn)定蛋白質(zhì)的正確結(jié)構(gòu)。在多種神經(jīng)變性疾病中,如帕金森癥、阿爾茲海默癥等,PDI可通過抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集以及遍在蛋白化,起到神經(jīng)保護(hù)作用。然而在一些退行性疾病中,PDI易與氧化應(yīng)激產(chǎn)生的NO結(jié)合,而形成S亞硝基化PDI (PDI-SNO)。 PDI-SNO可導(dǎo)致PDI的構(gòu)象發(fā)生改變,其原有的氧化、還原、異構(gòu)以及分子伴侶等功能受損。早在2006年,Uehara等在nature已報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)PDI及PDI-SNO在蛋白質(zhì)異常聚集相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中具有重要地位,在散發(fā)的PD和AD患者腦組織樣本中,PDI明顯被S-亞硝基化。我們?cè)谇捌谠囼?yàn)中已發(fā)現(xiàn),METH處理后,體內(nèi)外的氧化應(yīng)激都明顯增強(qiáng),NO生成明顯升高。然而,METH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)PDI的作用,以及PDI對(duì)異常表達(dá)的α-SN的作用機(jī)制研究還未見有報(bào)道,尚需要研究證實(shí)。本研究擬建立METH中毒細(xì)胞模型,通過形態(tài)學(xué)、NOS含量、NO含量、凋亡、α-SN聚集及PDI的S亞硝基化等指標(biāo)的檢測,進(jìn)一步驗(yàn)證METH引起中樞神經(jīng)毒性作用。再通過NOS抑制劑(L-NNA)和NO供體(L-Arginine)驗(yàn)證氧化應(yīng)激過程中PDI的變化,以及變化的PDI對(duì)異常表達(dá)的α-SN的影響,從而進(jìn)一步完善METH誘導(dǎo)的a-SN異常表達(dá)的毒性機(jī)制,為治療METH引起的毒性損傷提供理論基礎(chǔ)。目的：建立METH中毒細(xì)胞模型,并給予NOS抑制劑和NO供體,通過形態(tài)學(xué)、NOS含量、NO含量、凋亡、a-SN聚集及PDI的S亞硝基化等指標(biāo)的檢測,從而研究METH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)PDI正常功能的影響,以及PDI在a-SN異常表達(dá)中所起的作用。再通過siRNA干擾技術(shù)反證之前所得的結(jié)果,以進(jìn)一步明確METH、PDI以及a-SN這三者之間的聯(lián)系,為METH神經(jīng)毒性機(jī)制研究提供新的研究靶點(diǎn)。方法：1.METH中毒細(xì)胞模型的建立(1)10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基分別接種PC12細(xì)胞至96孔板中,在37℃和5%C02條件下培養(yǎng),待細(xì)胞長至70%匯合時(shí),分別用含Ommol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/LMETH的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),CCK-8法檢測細(xì)胞存活率變化。(2)接種PC12細(xì)胞至10個(gè)6cm小皿中,待細(xì)胞長至70%匯合時(shí),隨機(jī)分成兩組,其中一組的5個(gè)小皿用0.1mmol/L　L-NNA預(yù)處理30分鐘,處理之后,兩組的5個(gè)小皿的細(xì)胞分別用含Ommol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、 3mmol/LMETH的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),生物素轉(zhuǎn)化法和western Blot分別檢測各組細(xì)胞PDI-SNO表達(dá)變化,并綜合比較以選取適宜濃度的METH以建立中毒細(xì)胞模型。2.探究PDI對(duì)METH誘導(dǎo)的a-SN異常表達(dá)的作用機(jī)制接種PC12細(xì)胞至6孔板或96孔板或10cm培養(yǎng)皿中并將細(xì)胞分為6組：空白對(duì)照組(CON)、空白NOS抑制劑組(CON+L-NNA)、空白NO供體組(CON+L-Arginine)、給藥組(METH)、給藥NOS抑制劑組(METH+L-NNA)、給藥NO供體組(METH+L-Arginine),24小時(shí)后,收集細(xì)胞或細(xì)胞液進(jìn)行以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)：(1)倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷變化、CCK-8法觀察各組細(xì)胞存活率的表達(dá)變化。(2)TUNEL法和hoechst法檢測各組細(xì)胞凋亡情況。(3)酶化學(xué)法檢測NOS、NO的活性變化,Western B lot法檢測NOS表達(dá)情況。(4)生物素轉(zhuǎn)化法和Western Blot法檢測各組細(xì)胞PDI-SNO表達(dá)變化。(5)Western Blot法和免疫熒光法檢測a-SN表達(dá)變化,并采用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)a-SN形態(tài)變化。3.PDI基因沉默的PC12細(xì)胞在METH和L-NNA共同處理下細(xì)胞內(nèi)a-SN的表達(dá)情況(1)針對(duì)PDI基因設(shè)計(jì)并合成三條siRNA干擾序列,采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)處理PC12細(xì)胞,采用Western Blot法檢測出最有效的干擾序列。(2)采用最有效的干擾序列沉默PC12細(xì)胞的PDI表達(dá)后,用METH和L-NNA共同處理,采用Western Blot法和免疫熒光法檢測α-SN表達(dá)變化。結(jié)果：1.METH中毒細(xì)胞模型的建立(1)以未經(jīng)METH處理的PC12細(xì)胞為對(duì)照組,0.5-3mmol/L METH處理的PC12細(xì)胞存活率隨METH濃度增加逐漸降低,除0.5mmol/L處理組與對(duì)照組相比無顯著性差異(p0.05)外,其他各濃度處理組與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p0.05)。(2)相比于空白對(duì)照組,METH處理的PC12細(xì)胞PDI-SNO表達(dá)隨METH濃度增加逐漸增高,在METH濃度大于2mmol/L時(shí),PDI-SNO升高與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p0.05)。當(dāng)加入NOS抑制劑L-NNA時(shí),可顯著抑制METH引起的PDI-SNO表達(dá)升高,且當(dāng)METH濃度為3 mmol/L時(shí),抑制效果最為顯著(p0.01),故在后期試驗(yàn)中,選取3mmol/L濃度的METH建立中毒細(xì)胞模型。2.探究PDI對(duì)METH誘導(dǎo)的a-SN異常表達(dá)的作用機(jī)制(1)六組細(xì)胞模型分別經(jīng)過不同的處理24h后,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化,可見CON+L-NNA組細(xì)胞形態(tài)與CON組相比無明顯變化,而CON+L-Arginine組和METH組細(xì)胞形態(tài)與CON組相比明顯改變,可見胞體皺縮變圓,變圓細(xì)胞的胞質(zhì)透亮度增加可見環(huán)形透亮區(qū),且突起變短、斷裂、甚至消失,并可見細(xì)胞脫壁漂浮,METH+L-NNA組與METH組相比,細(xì)胞形態(tài)改變有明顯的改善,而METH+L-Arginine組與METH組相比,細(xì)胞形態(tài)改變更為顯著。CCK-8法測得CON+L-NNA組細(xì)胞存活率較CON組無明顯變化(P0.05), CON+L-Arginine組和METH組細(xì)胞存活率較CON組顯著下降(p0.05),METH+L-NNA組細(xì)胞存活率較METH組顯著升高(p0.05), METH+L-Arginine組細(xì)胞存活率較METH組顯著下降(p0.05)。(2)采用TUNEL法和hoechst法檢測6組細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)：CON+L-NNA組細(xì)胞凋亡較CON組無明顯變化(P0.05), CON+L-Arginine組和METH組細(xì)胞凋亡較CON組顯著下降(p0.05), METH+L-NNA組細(xì)胞凋亡較METH組顯著升高(p0.05), METH+L-Arginine組細(xì)胞凋亡較METH組顯著下降(p0.05)。(3)酶化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)：CON+L-NNA組細(xì)胞內(nèi)NOS和NO活性較CON組無明顯變化(P0.05),CON+L-Arginine組和METH組細(xì)胞內(nèi)NOS和NO活性較CON組顯著升高(p0.05),METH+L-NNA組細(xì)胞內(nèi)NOS和NO活性較METH組顯著降低(p0.05),METH+L-Arginine組細(xì)胞內(nèi)NOS和NO活性較METH組顯著升高(p0.05)。且通過Western Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)NOS表達(dá),結(jié)果與酶化學(xué)法檢測結(jié)果一致。(4)生物素轉(zhuǎn)化法和Western B lot法檢測各組細(xì)胞PDI-SNO表達(dá)發(fā)現(xiàn)：METH和L-Arginine可使PDI發(fā)生顯著的S亞硝基化,使得PDI-SNO表達(dá)顯著升高(p0.05),而L-NNA可有效抑制METH引起的PDI的S亞硝基化,L-Arginine則顯著加劇METH引起的PDI的S亞硝基化。(5)Western B lot法檢測各組細(xì)胞a-SN表達(dá)發(fā)現(xiàn)：CON+L-Arginine組和METH組細(xì)胞內(nèi)a-SN相比于CON組顯著升高(p0.05),而METH+L-NNA組細(xì)胞內(nèi)α-SN相比于METH組顯著降低(p0.05),METH+L-Arginine組細(xì)胞內(nèi)a-SN相比于METH組顯著升高(p0.05)。在共聚焦顯微鏡下觀察可見：CON+L-Arginine組和METH組細(xì)胞內(nèi)a-SN發(fā)生顯著聚集,L-NNA可有效抑制METH引起的a-SN的聚集,L-Arginine則顯著加劇METH引起的a-SN的聚集。3.PDI基因沉默的PC12細(xì)胞在METH和L-NNA共同處理下細(xì)胞內(nèi)a-SN的表達(dá)情況(1)針對(duì)PDI基因設(shè)計(jì)并合成三條siRNA干擾序列,采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)處理PC12細(xì)胞,采用Western Blot法檢測出最有效的干擾序列。結(jié)果顯示三條siRNA序列都能夠沉默PDI基因的表達(dá),其中第二條序列沉默效果最好。(2)采用最有效的干擾序列沉默PC12細(xì)胞的PDI基因表達(dá)后,再用METH和L-NNA共同處理細(xì)胞24h,Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)PDI沉默后的PC12細(xì)胞在METH和L-NNA共同處理下,L-NNA無法有效的抑制METH引起的a-SN的異常表達(dá),且在共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果也與前者一致,a-SN的聚集無法得到顯著抑制。結(jié)論：1. PDI-SNO在METH處理的PC12細(xì)胞株中表達(dá)顯著上調(diào),且上調(diào)趨勢隨METH濃度的增高而升高。NOS抑制劑L-NNA可有效抑制PDI-SNO的表達(dá),且當(dāng)METH的濃度為3mmol/L時(shí),抑制效果最為顯著。2.METH可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激及細(xì)胞內(nèi)a-SN發(fā)生聚集,氧化應(yīng)激使得PDI發(fā)生S亞硝基化而無法抑制α-SN的聚集,聚集的a-SN使得細(xì)胞毒性增強(qiáng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。NOS抑制劑L-NNA可有效抑制這一過程從而抑制METH的神經(jīng)毒性,而NO供體L-Areinine則作用相反。說明氧化應(yīng)激使得PDI功能異常,進(jìn)而無法通過抑制a-SN的聚集起到神經(jīng)保護(hù)作用。3.PDI基因沉默的PC12細(xì)胞即使加入NOS抑制劑L-NNA,也無法抑制METH導(dǎo)致a-SN的聚集。說明PDI是抑制a-SN聚集的關(guān)鍵分子。
【關(guān)鍵詞】：甲基苯丙胺(METH) α-突觸核蛋白(α-SN) 氧化應(yīng)激 二硫鍵異構(gòu)酶(PDI) 神經(jīng)毒性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749.64
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-18
• 前言18-23
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 第一章 METH中毒細(xì)胞模型的建立23-41
• 1 材料與方法23-34
• 1.1 材料和試劑23-28
• 1.2 方法28-34
• 2 結(jié)果34-36
• 2.1 不同濃度的METH處理,各組細(xì)胞存活率的變化34-35
• 2.2 L-NNA和不同濃度的METH共同處理,細(xì)胞內(nèi)PDI-SNO表達(dá)情況35-36
• 3 討論36-38
• 4 參考文獻(xiàn)38-41
• 第二章 探究PDI對(duì)METH誘導(dǎo)的α-SN表達(dá)異常的作用機(jī)制41-69
• 1 材料與方法41-52
• 1.1 材料和試劑41-45
• 1.2 方法45-52
• 2 結(jié)果52-64
• 2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化52-54
• 2.2 各組細(xì)胞存活率的變化54-55
• 2.3 各組細(xì)胞凋亡率的變化55-59
• 2.4 各組細(xì)胞NO含量變化59-60
• 2.5 各組細(xì)胞NOS活性變化60-61
• 2.6 各組細(xì)胞PDI-SNO含量變化61-62
• 2.7 各組細(xì)胞α-SN含量變化62-63
• 2.8 各組細(xì)胞α-SN形態(tài)變化63-64
• 3 討論64-66
• 4 參考文獻(xiàn)66-69
• 第三章 PDI基因沉默的PC12細(xì)胞在METH和L-NNA共同處理下細(xì)胞內(nèi)α-SN的表達(dá)情況69-78
• 1 材料與方法69-72
• 1.1 材料和試劑69-70
• 1.2 方法70-72
• 2 結(jié)果72-75
• 2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果72-73
• 2.2 PDI基因沉默后PC12細(xì)胞在METH和L-NNA共同處理下細(xì)胞內(nèi)α-SN含量變化73-74
• 2.3 PDI基因沉默后PC12細(xì)胞在METH和L-NNA共同處理下細(xì)胞內(nèi)α-SN形態(tài)變化74-75
• 3 討論75-76
• 4 參考文獻(xiàn)76-78
• 全文小結(jié)78-80
• 英文縮略詞注釋80-81
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果81-82
• 致謝82-83

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1000818