【摘要】：研究目的:創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是影響人類健康的重要疾病,具有高病死率和高致殘率的特點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)表明,TBI是45歲以下人群的主要死亡和致殘?jiān)�。由于罹患人群以青壯年為�?給個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了更大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前,TBI缺乏有效的治療方法,改善預(yù)后十分困難。尋找有效的神經(jīng)保護(hù)劑,是急需解決的醫(yī)學(xué)難題之一。氫氣作為一種新型醫(yī)學(xué)氣體分子,已應(yīng)用于治療多種疾病,并取得了良好的效果。氫用于醫(yī)療目的具有很多明顯的優(yōu)勢(shì):(1)氫氣可以選擇性清除氧自由基,不與具有重要信號(hào)作用的活性氧發(fā)生反應(yīng),不會(huì)破壞機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)。(2)氫氣可以輕易穿過(guò)血腦屏障,透過(guò)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(3)氫氣與羥自由基結(jié)合生成水,代謝產(chǎn)物安全無(wú)毒,可通過(guò)呼吸將多余的氫氣排出體外。miR-21在TBI的疾病過(guò)程中占有重要的地位。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),miR-21是唯一一個(gè)在創(chuàng)傷后6h、24h、48h和72h均有兩倍以上表達(dá)量變化的miRNA。前期研究還證實(shí),TBI后miR-21在腦組織神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平均升高,上調(diào)腦組織miR-21表達(dá)水平可以改善學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動(dòng)功能。此外,miR-21還具有抑制細(xì)胞凋亡,減少血腦屏障滲漏,促進(jìn)血管生成修復(fù)的作用。更重要的是,氫可以影響腦組織中miR-21的表達(dá)水平。本研究旨在證實(shí)氫對(duì)TBI后神經(jīng)功能缺損、前庭功能障礙、創(chuàng)傷灶體積、血腦屏障滲漏和腦水腫的治療作用,進(jìn)一步研究氫對(duì)TBI后神經(jīng)突起再生、神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,探討miR-21是否參與并調(diào)控了上述氫對(duì)TBI的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,為TBI的臨床藥物研究及治療新策略提供理論依據(jù)。方法:第一部分探討氫氣對(duì)TBI動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)作用。應(yīng)用CCI模型制備大鼠TBI模型,部分TBI大鼠給予氫氣吸入治療。應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS),評(píng)價(jià)氫氣治療對(duì)TBI大鼠的神經(jīng)功能缺損和行為學(xué)功能的改善作用;應(yīng)用平衡木實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)氫氣治療對(duì)TBI大鼠平衡能力及前庭功能的改善作用;通過(guò)行甲酚紫染色結(jié)合圖象分析技術(shù)測(cè)定腦損傷體積百分比,評(píng)價(jià)氫氣治療對(duì)TBI大鼠腦損傷灶的修復(fù)作用;通過(guò)對(duì)大鼠腦組織含水量的檢測(cè),評(píng)價(jià)氫氣治療對(duì)TBI大鼠腦水腫的改善作用;通過(guò)EB滲出量的測(cè)定,評(píng)價(jià)氫氣治療對(duì)TBI大鼠血腦屏障滲漏的改善作用;通過(guò)檢測(cè)抗氧化物酶SOD和CAT的活性以及氧化產(chǎn)物MDA和8-iso-PGF2α的水平,評(píng)價(jià)氫氣對(duì)TBI大鼠氧化應(yīng)激的抑制作用。第二部分探討miR-21是否參與了氫氣對(duì)TBI動(dòng)物模型神經(jīng)保護(hù)作用的調(diào)節(jié)。通過(guò)CCI模型制備大鼠TBI模型,部分TBI大鼠接受氫氣吸入治療,部分TBI大鼠通過(guò)側(cè)腦室注射給予脂質(zhì)體攜帶的miRNA-21 antagomir干預(yù)。應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TBI后0至3天miR-21的表達(dá)水平變化。再應(yīng)用上述方法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損、平衡能力及前庭功能、腦損傷體積、腦水腫程度、血腦屏障滲漏和氧化應(yīng)激指標(biāo),以探討miRNA-21是否影響氫氣對(duì)TBI的保護(hù)作用。第三部分探討富氫液對(duì)TBI細(xì)胞模型的神經(jīng)保護(hù)作用。采用劃痕損傷細(xì)胞方法制作原代神經(jīng)元細(xì)胞TBI模型,部分神經(jīng)元給予富氫液培養(yǎng)干預(yù)。應(yīng)用MTT法,分析富氫液對(duì)原代神經(jīng)元TBI模型細(xì)胞活力水平的改善作用;應(yīng)用LDH法,分析富氫液對(duì)原代神經(jīng)元TBI模型細(xì)胞受損水平的改善作用;通過(guò)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物βⅢ-Tubulin的免疫熒光染色,對(duì)神經(jīng)突起分支及突起長(zhǎng)度進(jìn)行定量分析,評(píng)價(jià)富氫液對(duì)原代神經(jīng)元TBI模型細(xì)胞神經(jīng)突起的修復(fù)作用;應(yīng)用Western blot法測(cè)定各種凋亡相關(guān)蛋白,應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)原代神經(jīng)元的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比,評(píng)價(jià)富氫液對(duì)原代神經(jīng)元TBI模型細(xì)胞凋亡的抑制作用;通過(guò)檢測(cè)抗氧化物酶SOD和CAT的活性以及氧化產(chǎn)物MDA的水平,評(píng)價(jià)富氫液對(duì)原代神經(jīng)元TBI模型氧化應(yīng)激的抑制作用。第四部分探討miR-21是否參與了富氫液對(duì)TBI細(xì)胞模型神經(jīng)保護(hù)作用的調(diào)節(jié)。采用劃痕損傷細(xì)胞方法制作PC12神經(jīng)元TBI模型,部分TBI細(xì)胞模型給予富氫液干預(yù),部分TBI細(xì)胞模型給予miRNA-21 antagomir干預(yù)。應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞模型miR-21的表達(dá)水平差異。評(píng)價(jià)富氫液對(duì)PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力、細(xì)胞受損水平、神經(jīng)突起修復(fù)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響,并探討miRNA-21在富氫液對(duì)TBI的保護(hù)中的作用。結(jié)果:在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,(1)氫氣可改善TBI后神經(jīng)功能的缺損;(2)氫氣可改善TBI大鼠平衡能力和前庭功能;(3)氫氣可顯著減少腦損傷體積百分比;(4)氫氣可減少TBI后腦水腫和血腦屏障滲漏;(5)氫氣可改善TBI后的氧化應(yīng)激。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,(1)氫氣上調(diào)TBI大鼠miR-21的表達(dá),miR-21 antagomir可以下調(diào)miR-21的表達(dá)。(2)miR-21 antagomir可以減弱氫氣對(duì)神經(jīng)功能缺損的保護(hù)作用。(3)miR-21 antagomir可以減弱氫氣對(duì)平衡能力和前庭功能的保護(hù)作用。(4)miR-21 antagomir可以減弱氫氣對(duì)腦損傷體積的保護(hù)作用。(5)miR-21 antagomir可以減弱氫氣對(duì)腦水腫和血腦屏障滲漏的保護(hù)作用。(6)miR-21 antagomir可以減弱氫氣對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,(1)富氫液可以改善原代神經(jīng)元細(xì)胞活力;(2)富氫液可以改善細(xì)胞受損水平;(3)富氫液可以促進(jìn)神經(jīng)突起數(shù)量增加和長(zhǎng)度的延長(zhǎng);(4)富氫液可以抑制神經(jīng)元的凋亡;(5)富氫液可以抑制氧化應(yīng)激。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,(1)富氫液可以提高PC12細(xì)胞模型中miR-21的表達(dá)水平,此作用可被miR-21 antagomir拮抗。(2)miR-21 antagomir可以減弱富氫液對(duì)PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的保護(hù)作用。(3)miR-21 antagomir可以減弱富氫液對(duì)PC12神經(jīng)元細(xì)胞受損的保護(hù)作用。(4)miR-21 antagomir可以減弱富氫液對(duì)PC12神經(jīng)元神經(jīng)突起再生的保護(hù)作用。(5)miR-21 antagomir可以減弱富氫液對(duì)PC12神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用。(6)miR-21 antagomir可以減弱富氫液對(duì)PC12神經(jīng)元氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。結(jié)論1、氫氣在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)這兩個(gè)水平上對(duì)TBI模型均具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用,可以明顯改善神經(jīng)缺損和平衡功能,減少創(chuàng)傷灶體積,抑制腦水腫和血腦屏障滲漏,改善神經(jīng)元細(xì)胞活力及受損水平,促進(jìn)損傷神經(jīng)突起再生,抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。2、miR-21參與了氫氣對(duì)TBI保護(hù)作用的調(diào)節(jié),氫氣在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對(duì)TBI的保護(hù)作用。3、氫氣可以作為TBI后繼發(fā)性腦損傷的潛在治療手段,本研究為更加深入的氫分子治療機(jī)制方面的研究奠定了一定的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

從而改善了急性一氧化碳中毒期間的記憶、學(xué)習(xí)外，，氫治療還可以用于新生兒缺氧缺血的治療，研究發(fā)e-3 的活性，并抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)的作用究發(fā)現(xiàn)，氫可以下調(diào)多種促炎因子（如白介素-1β、白介、細(xì)胞間細(xì)胞粘附分子 1 和高性能組盒蛋白 1）和促凋aspase-12, caspase-8和Bax）的表達(dá)[29, 30]。氫還可以調(diào)節(jié)m 表達(dá)，以減少炎癥損傷。氫還被證明可以誘導(dǎo)血管發(fā)生觸發(fā)生和神經(jīng)突觸可塑性所必需的條件。在血管生成過(guò)磷酸降解磷酸二酯酶的活性，從而提高體內(nèi)環(huán)鳥(niǎo)苷酸的增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，刺激釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)生成；通過(guò) Cys6 和 Cys26 的相互作用，開(kāi)啟三磷酸腺苷APK 途徑，最終促進(jìn)血管生成[46]。此外，氫還參與自噬線粒體形態(tài)學(xué)調(diào)控等。不斷發(fā)展的氫治療機(jī)制研究，為應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)（圖 1）。

圖 2 miR-21 在 TBI 發(fā)病機(jī)制中的作用（Ji W, et al. 2018）本課題組的前期研究中已經(jīng)建立了 TBI 大鼠模型創(chuàng)傷灶在受傷后不同時(shí)間段的 miRNA 表達(dá)譜，并篩選出 miRNA-21 是唯一一個(gè)在創(chuàng)傷后 6h、24h、48h和 72h 均有兩倍以上表達(dá)量變化的 miRNA[64,65]。我們進(jìn)一步證實(shí)，實(shí)驗(yàn)大鼠發(fā)生 TBI 后 miRNA-21 在腦組織神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平均升高。上調(diào)腦組織 miRNA-21 水平具有提高學(xué)習(xí)記憶及改善運(yùn)動(dòng)功能的作用。miRNA-21 在 TBI 動(dòng)物模型中表現(xiàn)出抗細(xì)胞凋亡作用，還可以減少血腦屏障滲漏，并促進(jìn)腦組織血管生成修復(fù)[66,67]。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)，TBI 動(dòng)物模型在接受氫治療后，miRNA-21 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)顯著的變化[68]。所以，miRNA-21 與腫瘤、心腦血管疾病等多種疾病存在關(guān)聯(lián)，參與炎癥、細(xì)胞凋亡、血腦屏障損傷、血管再生和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等多種病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，而這些病理生理過(guò)程均與 TBI 有關(guān)。更為重要的是，氫可以影響miRNA-21 的表達(dá)。因此，氫介導(dǎo)下的 miRNA-21 很可能在 TBI 治療中發(fā)揮重要作用。綜上所述，TBI 是一種常見(jiàn)并需要高度關(guān)注的外傷疾病，具有死亡率高、
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R651.15

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本文編號(hào)：2677954