【摘要】：背景表皮細胞生理行為對于皮膚創(chuàng)傷后再上皮化和組織結構的重塑具有重要作用。然而,其作用的調控機制及其影響因素未完全闡明。因此,闡明表皮細胞增殖、分化和有絲分裂調控的影響因素及其相關分子機制,有利于引導皮膚創(chuàng)傷后創(chuàng)面組織的有序修復,或為形成結構和功能兼?zhèn)涞钠つw組織替代物提供理論基礎,從而最終實現(xiàn)無延遲、無瘢痕的完美修復。材料和方法1.收集臨床手術中的正常皮膚組織(Normal)7例、創(chuàng)面組織(Wound edge)8例和瘢痕組織(Scar)7例,通過HE、Masson和六胺銀染色比較其組織形態(tài)學差異。采用免疫熒光染色檢測基底膜成份Ⅳ型膠原(Collagen IV)、層粘連蛋白(Laminin)和Laminin-5及其受體整合素(Integrin-β4)的表達分布差異,同時檢測CK10、CK14、 CK5、CK19和Integrin-β1的表達以明確三種組織內表皮細胞分化譜系的差異。2.使用Ca2+刺激原代人表皮角質形成細胞(Human epidermal keratinocyte, HEK)和人永生化表皮細胞(Human immortalized keratinocyte, HaCaT)構建表皮細胞分化的體外模型。體外采用MaxGelTM ECM模擬表皮基底膜,通過免疫熒光和Westernb1ot檢測Integrin-β4表達情況,并通過Real-time qPCR和Western blot檢測CK10、CK14和CK19的表達水平,明確其對IEK和HaCaT細胞增殖和分化行為的影響。3.采用激光共聚焦斷層掃描結合三維組織結構重建技術,比較Normal、Wounde edge和Scar組織中細胞極性蛋白分子姍的表達分布情況,并通過Pericentrin知Survivin分別標記中心粒(Centrosome)和中心顆粒體(Spindle midbody),從兩種途徑來分析三種組織內表皮細胞的有絲分裂方向差異。4.采用免疫熒光染色檢測PAR3和Integrin-β4在Nornal、Wounde edge知Scar組織表達分布關系,同時檢測三種組織內真皮成纖維細胞(Human dermal fibroblast,HDF)標記分子α-S№的表達分布情況。體外使用MaxGelTM ECM模擬袁皮基底膜,同時聯(lián)合HDF細胞培養(yǎng)上清液,借助激光共聚焦斷層掃描結合三維組織結構重建技術分析二者對HEK和HaCaT細胞內PAR3和Integrin-β4空間表達分布的影響,并通過Real-time qPCR和Western blot檢測二者對HEK和HaCaT細胞內PAR3.Integrin-β4表達水平的影響,從而探索表皮細胞有絲分裂方向調控的分子機制。此外,采用Micro-contact printing結合Time-lapse相差顯微鏡實時觀察分析細胞外基質(extracellular matrix,ECM)和HDF細胞對HEK細胞有絲分裂方向的調控作用。結果1.創(chuàng)傷修復中的NormalβWound edge和Scar組織形態(tài)結構及表皮細胞分化譜系均存在明顯差異。相對于Normal組織,Wound edge組織表皮細胞呈明顯增殖狀態(tài),而Scar組織基底膜結構異常,且袁皮細胞呈高分化狀態(tài)。這提示,基底膜可能影響表皮細胞的分化譜系,進而干預創(chuàng)傷修復的結局。2.體外使用MaxGelTM ECM模擬表皮基底膜可以增強HEK和HaCaT細胞內Integrin-β4的表達水平,抑制Ca2+刺激引起的HEK和HaCaT細胞分化。這表明,基底膜能夠通過與表皮細胞的黏附活動,調控其增殖和分化行為。3.表皮細胞極性蛋白分子PAR3 在Normal.Wound edge和Scar組織表達分布不同,且表皮細胞的有絲分裂方向存在明顯差異,表現(xiàn)為其在Normal和Woundedge組織呈有序分裂,而在Scar組織成無序的紊亂分裂。這提示,創(chuàng)傷修復過程中,表皮細胞有絲分裂方向與修復結局密切相關,其可能受基底膜黏附作用的影響。4.PAR3 和Integrin-β4在Normal.Wounde edge和Scar組織均呈共定位表達分布。其中,Scar組織基底膜處PAR3 和Integrin-β4表達分布異常,同時其基底膜側a-SMA表達陽性的HDF細胞數(shù)量減少,提示創(chuàng)傷修復早期區(qū)域性的瑚DF細胞缺失可能與基底膜修復異常有關。體外使用MaxGelTM ECM模擬表皮基底膜,同時聯(lián)合HDF細胞培養(yǎng)上清液,均可以影響PAR3 和Integrin-β4在HEK和HaCaT細胞空間表達分布和表達水平,其作用機制可能有涉及到ERK通路。此外,體外HDF細胞培養(yǎng)上清液可以影響ECM與HEK細胞黏附作用,調控HEK有絲分裂的方向。這表明,基底膜可以通過與表皮細胞的黏附活動,調控其有絲分裂的方向,這在皮膚創(chuàng)傷修復具有重要作用。結論皮膚創(chuàng)傷修復過程中,基底膜可以通過其與表皮細胞的黏附作用,影響表皮細胞生活的外界微環(huán)境,調控表皮細胞的增殖、分化及有絲分裂方向等細胞行為,從而干預創(chuàng)傷后再上皮化和上皮組織結構重塑。而創(chuàng)傷修復早期,HDF細胞的缺失可能是基底膜異常形成的細胞學基礎之一。因此,探索基底膜形成的影響因素,及其對表皮細胞行為的調控作用和相關機制,可以為實現(xiàn)完美的皮膚創(chuàng)傷修復提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R641

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本文編號：2569789