【摘要】：【研究目的】以重組人FcγRI胞外段蛋白作為靶分子,應用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技術,從體外合成組合化學的96 nt隨機ss DNA核酸文庫中篩選出人FcγRI高親和力和高特異性的適配子,用人FcγRI特異性核酸適配子建立初步的、應用于膿毒血癥實驗診斷的新方法�！痉椒ā�1.體外化學合成96 nt隨機ss DNA核酸文庫,文庫中核酸序列的兩端均為18 nt固定的引物序列,中間為60 nt的隨機序列,以重組人FcγRI蛋白片段為靶標,應用SELEX技術篩選針對人FcγRI高親和力和特異性的核酸適配子,用熒光標記法檢測ss DNA富集文庫與人FcγRI的結合力;2.將第7、8輪篩選PCR產(chǎn)物TA克隆、測序,采用相關軟件對測序的單克隆核酸適配子進行生物信息學分析;3.挑選人FcγRI單克隆核酸適配子,使用流式細胞儀和熒光顯微鏡測定其親和力、靈敏度和特異性。【結果】1.熒光定量分析顯示,第6輪篩選ss DNA富集庫與人FcγRI結合力達到峰值,ss DNA富集庫與該靶標的結合位點達到飽和狀態(tài);2.結合Clustal X 1.83、Mega 5和RNAstructure 5.6分別將第7、8輪單克隆適配子分成7和5個家族;第7輪篩選的33條核酸適配子中有三對完全一致的富集序列;RNAstructure 5.6模擬的核酸適配子的二級結構主要以莖-環(huán)和G-四聚體結構為主;3.流式細胞分析結合軟件計算適配子LW7-1、LW7-9與LW7-27的親和力分別為12.76 n M、14.03 n M、6.676 n M,Kd值均達到納摩爾水平,適配子檢測細胞數(shù)可低至2×106個;4.流式細胞儀分析結果顯示,LW7-1、LW7-9和LW7-27與膿毒血癥中性粒細胞結合的熒光強度明顯比陰性對照和正常對照強,說明這三條適配子是針對中性粒細胞表面的FcγRI蛋白的;5.熒光顯微鏡分析顯示,三條適配子均能夠單獨或協(xié)同檢測膿毒血癥中性粒細胞,LW7-9所染細胞熒光強度最強,是我們后續(xù)研究的重點,熒光標記適配子直接檢測法(FLADA)也是我們建立的初步的、由熒光顯微鏡檢查的、有望實現(xiàn)膿毒血癥鑒別診斷的新方法�！窘Y論】本研究運用SELEX技術經(jīng)過8輪篩選,獲取針對人重組FcγRI胞外段蛋白特異性ss DNA核酸適配子,我們對部分核酸適配子進行了親和力、靈敏度和特異性分析,建立了初步的、由熒光顯微鏡檢查的、有望實現(xiàn)膿毒血癥鑒別診斷的FLADA法,為建立定量或半定量的床邊檢測(Point Of Care Testing,POCT)方法奠定了基礎。
【圖文】：

核酸適配子也可通過連接藥物分子、納米顆粒、病毒載體、脂質體、聚乙二醇等用于臨床治療。圖2 核酸適配子常見的化學修飾位點Figure 2 Common chemical modified epitopes of aptamers7. 無毒性、免疫原性小，組織穿透性好：這是適配子作為藥物或體內定位和檢查的最突出的優(yōu)勢。上述這些特性說明，適配子可作為一種新的分子探針應用于分子醫(yī)學研究，， 核酸適配子目前在國內外被廣泛應用于基礎研究和應用研究。主要包括：1.蛋白質與核酸的作用機制，主要用于研究疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制；2.獲取高效、特異性的靶蛋白抑制劑，用于蛋白質功能研究和新藥研制等；3.在實驗診斷方面，核酸適配子作為檢測分子，正在取代或聯(lián)合抗體被廣泛應用于ELISA法、熒光原位雜交、Westernblotting、芯片技術、流式細胞技術、熒光偏振、毛細管電泳和芯片技術等方面，用于檢測不同生物分子

圖 3 以磁珠為親和介質的蛋白 SELEX 篩選示意圖[25]igure 3 Schematic representation of SELEX for protein immobilized on magnetic beads二、實驗結果
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7

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相關博士學位論文 前1條

1 李衛(wèi)濱;重組人FcγRI核酸適配子的體外篩選及其在膿毒血癥實驗診斷中的應用研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

本文編號：2558285