【摘要】：【研究目的】以重組人FcγRI胞外段蛋白作為靶分子,應(yīng)用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技術(shù),從體外合成組合化學(xué)的96 nt隨機(jī)ss DNA核酸文庫(kù)中篩選出人FcγRI高親和力和高特異性的適配子,用人FcγRI特異性核酸適配子建立初步的、應(yīng)用于膿毒血癥實(shí)驗(yàn)診斷的新方法�！痉椒ā�1.體外化學(xué)合成96 nt隨機(jī)ss DNA核酸文庫(kù),文庫(kù)中核酸序列的兩端均為18 nt固定的引物序列,中間為60 nt的隨機(jī)序列,以重組人FcγRI蛋白片段為靶標(biāo),應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選針對(duì)人FcγRI高親和力和特異性的核酸適配子,用熒光標(biāo)記法檢測(cè)ss DNA富集文庫(kù)與人FcγRI的結(jié)合力;2.將第7、8輪篩選PCR產(chǎn)物TA克隆、測(cè)序,采用相關(guān)軟件對(duì)測(cè)序的單克隆核酸適配子進(jìn)行生物信息學(xué)分析;3.挑選人FcγRI單克隆核酸適配子,使用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡測(cè)定其親和力、靈敏度和特異性。【結(jié)果】1.熒光定量分析顯示,第6輪篩選ss DNA富集庫(kù)與人FcγRI結(jié)合力達(dá)到峰值,ss DNA富集庫(kù)與該靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài);2.結(jié)合Clustal X 1.83、Mega 5和RNAstructure 5.6分別將第7、8輪單克隆適配子分成7和5個(gè)家族;第7輪篩選的33條核酸適配子中有三對(duì)完全一致的富集序列;RNAstructure 5.6模擬的核酸適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以莖-環(huán)和G-四聚體結(jié)構(gòu)為主;3.流式細(xì)胞分析結(jié)合軟件計(jì)算適配子LW7-1、LW7-9與LW7-27的親和力分別為12.76 n M、14.03 n M、6.676 n M,Kd值均達(dá)到納摩爾水平,適配子檢測(cè)細(xì)胞數(shù)可低至2×106個(gè);4.流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,LW7-1、LW7-9和LW7-27與膿毒血癥中性粒細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度明顯比陰性對(duì)照和正常對(duì)照強(qiáng),說明這三條適配子是針對(duì)中性粒細(xì)胞表面的FcγRI蛋白的;5.熒光顯微鏡分析顯示,三條適配子均能夠單獨(dú)或協(xié)同檢測(cè)膿毒血癥中性粒細(xì)胞,LW7-9所染細(xì)胞熒光強(qiáng)度最強(qiáng),是我們后續(xù)研究的重點(diǎn),熒光標(biāo)記適配子直接檢測(cè)法(FLADA)也是我們建立的初步的、由熒光顯微鏡檢查的、有望實(shí)現(xiàn)膿毒血癥鑒別診斷的新方法。【結(jié)論】本研究運(yùn)用SELEX技術(shù)經(jīng)過8輪篩選,獲取針對(duì)人重組FcγRI胞外段蛋白特異性ss DNA核酸適配子,我們對(duì)部分核酸適配子進(jìn)行了親和力、靈敏度和特異性分析,建立了初步的、由熒光顯微鏡檢查的、有望實(shí)現(xiàn)膿毒血癥鑒別診斷的FLADA法,為建立定量或半定量的床邊檢測(cè)(Point Of Care Testing,POCT)方法奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

核酸適配子也可通過連接藥物分子、納米顆粒、病毒載體、脂質(zhì)體、聚乙二醇等用于臨床治療。圖2 核酸適配子常見的化學(xué)修飾位點(diǎn)Figure 2 Common chemical modified epitopes of aptamers7. 無毒性、免疫原性小，組織穿透性好：這是適配子作為藥物或體內(nèi)定位和檢查的最突出的優(yōu)勢(shì)。上述這些特性說明，適配子可作為一種新的分子探針應(yīng)用于分子醫(yī)學(xué)研究，， 核酸適配子目前在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。主要包括：1.蛋白質(zhì)與核酸的作用機(jī)制，主要用于研究疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制；2.獲取高效、特異性的靶蛋白抑制劑，用于蛋白質(zhì)功能研究和新藥研制等；3.在實(shí)驗(yàn)診斷方面，核酸適配子作為檢測(cè)分子，正在取代或聯(lián)合抗體被廣泛應(yīng)用于ELISA法、熒光原位雜交、Westernblotting、芯片技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、熒光偏振、毛細(xì)管電泳和芯片技術(shù)等方面，用于檢測(cè)不同生物分子

圖 3 以磁珠為親和介質(zhì)的蛋白 SELEX 篩選示意圖[25]igure 3 Schematic representation of SELEX for protein immobilized on magnetic beads二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R459.7

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1 李衛(wèi)濱;重組人FcγRI核酸適配子的體外篩選及其在膿毒血癥實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2558285