【摘要】：【研究目的】 本實(shí)驗(yàn)旨在研究盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP）膿毒癥小鼠肝臟PD-L1分子的表達(dá)變化；探索應(yīng)用抗PD-L1抗體治療對(duì)膿毒癥小鼠是否具有肝治療作用，并檢測(cè)其對(duì)肝臟內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以此探求其在膿毒癥肝損傷中的作用，為膿毒癥肝功能保護(hù)性的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【研究方法】 1、將16只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham，n=8）、CLP組（CLP，n=8），采用CLP術(shù)致膿毒癥模型。于手術(shù)后24h取小鼠肝臟，，分離左葉、右葉。左葉切割為約1.5cm×1.5cm×1cm大小后，立即行組織冰凍包埋，于冰凍切片機(jī)上行切片（厚度5μm）。切片經(jīng)固定后行抗PD-L1的免疫組織化學(xué)染色，抗體標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）。顯微鏡下觀察并分析兩組切片中PD-L1表達(dá)水平。右葉切割出1cm×1cm×1cm大小，經(jīng)勻漿后提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后行Q-RT-PCR，定量檢測(cè)肝組織中PD-L1的mRNA表達(dá)水平。 2、將32只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham, n=8）、CLP組（CLP, n=8）、同型對(duì)照組（Isotype, n=8）和抗PD-L1組（Anti-PD-L1, n=8），除假手術(shù)組外其余小鼠均行CLP術(shù)，同型對(duì)照組和抗PD-L1組于CLP術(shù)后1h分別經(jīng)腹腔給予同型對(duì)照抗體或抗PD-L1抗體（50μg/200μl，每只）。手術(shù)24h后取小鼠心臟血檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase, AST），并取小鼠肝組織行固定、石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色，根據(jù)ALT、AST水平和肝臟病理切片鏡下觀察結(jié)果綜合評(píng)價(jià)肝功能損傷程度。另取各組小鼠肝組織，勻漿后提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后行Q-RT-PCR，檢測(cè)肝組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的mRNA水平。 【結(jié)果】 1、肝臟冰凍切片免疫組織化學(xué)染色后，于顯微鏡下發(fā)現(xiàn)CLP小鼠肝臟中實(shí)質(zhì)細(xì)胞PD-L1表達(dá)陽(yáng)性，假手術(shù)組小鼠肝臟未見(jiàn)PD-L1表達(dá)。對(duì)肝組織勻漿并行Q-RT-PCR后，結(jié)果顯示CLP術(shù)后24h的小鼠肝臟中PD-L1的mRNA表達(dá)較假手術(shù)組上調(diào)5.67倍（P0.01）。 2、CLP術(shù)后24h時(shí)，CLP組、同型對(duì)照組小鼠的外周血血漿ALT和AST較假手術(shù)組顯著提高（P0.01），而抗PD-L1組小鼠外周血血漿ALT和AST較CLP組和同型對(duì)照組小鼠顯著降低（P0.01）。肝臟病理切片HE染色鏡下結(jié)果提示，CLP組和同型對(duì)照組小鼠的肝臟出現(xiàn)明顯的炎性浸潤(rùn)和細(xì)胞變性，而抗PD-L1組小鼠的肝臟損傷較CLP組則有所減輕。Q-RT-PCR結(jié)果表明，CLP組及同型對(duì)照組小鼠肝臟中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10的mRNA水平較Sham組顯著上調(diào)（P0.01）�？筆D-L1組小鼠肝臟中IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA水平較CLP組和同型對(duì)照組小鼠顯著升高，而IFN-γ的mRNA水平則顯著降低（P0.01）。 【結(jié)論】 CLP致膿毒癥小鼠可出現(xiàn)顯著的肝臟損傷，表現(xiàn)為血漿ALT和AST水平顯著升高，肝臟HE染色示肝臟變形及炎性浸潤(rùn)。膿毒癥小鼠肝臟PD-L1表達(dá)在蛋白水平和mRNA水平上均顯著上調(diào)。在體應(yīng)用抗PD-L1抗體可對(duì)CLP致肝損傷的小鼠發(fā)揮顯著的保護(hù)作用，表現(xiàn)為顯著降低血漿ALT和AST水平，減輕小鼠肝臟病理?yè)p傷程度；應(yīng)用抗PD-L1抗體可下調(diào)膿毒癥小鼠肝臟內(nèi)TNF-α、IL-10和IL-6的mRNA水平，上調(diào)IFN-γ的mRNA水平，提示抗PD-L1抗體可抑制肝臟過(guò)激免疫反應(yīng)，減輕CLP膿毒癥小鼠因過(guò)度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的嚴(yán)重肝臟功能損傷。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R459.7

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2540989