【摘要】：目的： 實(shí)驗(yàn)一： 1、觀察慢病毒載體轉(zhuǎn)染HaCaT效率,構(gòu)建miR-26a轉(zhuǎn)染細(xì)胞株模型的可能性； 2、比較轉(zhuǎn)染miR-26a促進(jìn)劑和抑制劑對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響； 3、比較轉(zhuǎn)染miR-26a促進(jìn)劑和抑制劑對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響； 4、比較轉(zhuǎn)染miR-26a促進(jìn)劑和抑制劑對(duì)HaCaT細(xì)胞PTEN/AKT/GSK3β通路相關(guān)因子表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)二： 1、比較正常氧和乏氧條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的mir-26a的表達(dá)變化； 2、比較正常氧和乏氧條件下HUVECs PTEN基因的表達(dá)變化； 3、比較正常氧和乏氧條件對(duì)HUVECs PTEN/AKT/VEGF通路相關(guān)因子表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)三： 1、觀察局部應(yīng)用miR-26a抑制劑對(duì)小鼠創(chuàng)面組織miR-26a表達(dá)的影響； 2、觀察局部應(yīng)用miR-26a抑制劑對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合速度和愈合質(zhì)量的影響。 實(shí)驗(yàn)四： 1、觀察與正常C57小鼠相比db/db糖尿病小鼠創(chuàng)面局部miR-26a的表達(dá)變化； 2、觀察局部應(yīng)用miR-26a抑制劑對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面組織miR-26a表達(dá)的影響；3、觀察局部應(yīng)用miR-26a抑制劑對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合速度和愈合質(zhì)量的影響。 方法： 實(shí)驗(yàn)一： 構(gòu)建慢病毒載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-26a的慢病毒。用構(gòu)建好的miR-26a慢病毒感染HaCaT細(xì)胞,建立了miR-26a表達(dá)增強(qiáng)或抑制的細(xì)胞模型。采用CCK8試劑盒對(duì)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。采用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別在mRNA和蛋白表達(dá)水平上檢測(cè)不同組細(xì)胞PTEN/AKT/GSK3β通路相關(guān)因子的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)二： 用三氣培養(yǎng)箱構(gòu)建常氧及乏氧環(huán)境,體外培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞48小時(shí)。采用RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞miR-26a和PTEN的表達(dá)差異,Western blot技術(shù)在蛋白表達(dá)水平上檢測(cè)不同組細(xì)胞PTEN/AKT/VEGF通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)三： 制作小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,設(shè)為miR-26a抑制劑組和對(duì)照組,對(duì)創(chuàng)面愈合速度、肉芽組織厚度、表達(dá)CD31的新生血管、表達(dá)Ki67的增殖期細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 實(shí)驗(yàn)四： 制作糖尿病小鼠和C57小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,設(shè)為C57非糖尿病組和糖尿病組,檢測(cè)局部miR-26a的表達(dá)。制作糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,設(shè)為miR-26a抑制劑組和對(duì)照組,對(duì)創(chuàng)面愈合速度、肉芽組織厚度、表達(dá)CD31的新生血管進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一： 建立了miR-26a表達(dá)增強(qiáng)或抑制的細(xì)胞模型,72小時(shí)在熒光顯微鏡下對(duì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上。在培養(yǎng)24h后,轉(zhuǎn)染miR-26a抑制劑組的OD值便顯著高于其他各組(p0.05),轉(zhuǎn)染miR-26a促進(jìn)劑組的OD值在培養(yǎng)48h后顯著低于其他各組(p0.05)。從24h起,轉(zhuǎn)染miR-26a抑制劑組細(xì)胞的劃痕寬度就明顯小于其它組,該組細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)(P0.01)。在48h時(shí),轉(zhuǎn)染niR-26a抑制劑組細(xì)胞的劃痕區(qū)域愈合。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染mir-26a抑制劑細(xì)胞組中PTEN的表達(dá)與其他組的差異具有顯著性(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,與其他組相比,抑制劑組β-catenin和AKT蛋白表達(dá)明顯升高,PTEN和GSK3β蛋白明顯降低。 實(shí)驗(yàn)二： 培養(yǎng)48小時(shí)后,兩種方法處理后,乏氧組細(xì)胞株中miR-26a和PTEN的表達(dá)交常氧組明顯降低,差異具有顯著性(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,與常氧組相比,乏氧組HIF-1、VEGFAKT蛋白表達(dá)明顯升高,PTEN蛋白明顯降低。 實(shí)驗(yàn)三： miR-26a抑制劑組較對(duì)照組創(chuàng)面愈合速度明顯加快。術(shù)后第10天,miR-26a抑制劑組創(chuàng)面肉芽組織厚度為對(duì)照組的2倍(P0.05)每張切片內(nèi)CD31陽(yáng)性新生血管數(shù)分別為65.0±11.7和33.5±13.0(P0.05),Ki67陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比分別為69.5±15.7和46.3±14.0(P0.01)。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)四： 創(chuàng)面模型建立后3天,db/db組miR-26a表達(dá)水平是C57組的2.0倍(P0.05)術(shù)后第10天,miR-26a抑制劑組創(chuàng)面肉芽組織厚度為對(duì)照組的2.3倍(P0.05),每張切片內(nèi)CD31陽(yáng)性新生血管數(shù)分別為47.8±13.2和30.5±6.6(P0.05)。 結(jié)論： 實(shí)驗(yàn)一： 1、利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染HaCaT,可以構(gòu)建成功而穩(wěn)定的miR-26a轉(zhuǎn)染細(xì)胞株模型； 2、轉(zhuǎn)染miR-26a抑制劑后HaCaT細(xì)胞增殖能力較轉(zhuǎn)染miR-26a促進(jìn)劑細(xì)胞和空白組明顯增強(qiáng)； 3、轉(zhuǎn)染miR-26a抑制劑后HaCaT細(xì)胞遷移能力較轉(zhuǎn)染miR-26a促進(jìn)劑細(xì)胞和空白組明顯增強(qiáng)； 4、轉(zhuǎn)染miR-26a抑制劑后HaCaT細(xì)胞PTEN的表達(dá)明顯降低,miR-26a可能通過(guò)調(diào)控PTEN/AKT/GSK3β通路相關(guān)因子的表達(dá)影響細(xì)胞生物活性。 實(shí)驗(yàn)二： 1、乏氧條件可以抑制HUVECs的mir-26a的表達(dá)； 2、在乏氧條件下HUVECs PTEN基因的表達(dá)明顯下降； 3、乏氧條件可能通過(guò)miR-26a調(diào)控PTEN/AKT/VEGF通路相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)一步影響細(xì)胞生物活性。 實(shí)驗(yàn)三： 1、局部應(yīng)用miR-26a抑制劑可明顯降低小鼠創(chuàng)面組織miR-26a的表達(dá)； 2、局部應(yīng)用miR-26a抑制劑可明顯增加小鼠創(chuàng)面的肉芽組織厚度、新生血管數(shù)量和增殖細(xì)胞比例,從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合速度。 實(shí)驗(yàn)四： 1、與非糖尿病小鼠比糖尿病小鼠創(chuàng)面局部miR-26a表達(dá)明顯增多； 2、局部應(yīng)用miR-26a抑制劑可明顯降低糖尿病小鼠創(chuàng)面組織miR-26a的表達(dá)； 3、局部應(yīng)用miR-26a抑制劑可明顯增加糖尿病小鼠創(chuàng)面的肉芽組織厚度、新生血管數(shù)量和增殖細(xì)胞比例,從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合速度。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R641
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本文編號(hào)：2409744