發(fā)布時(shí)間：2018-12-18 08:16

【摘要】：皮膚創(chuàng)傷愈合(wound healing)是復(fù)雜而又有規(guī)律的修復(fù)過程,根據(jù)皮膚的不同部位,以及不同原因造成的不同損傷,創(chuàng)傷可以分為很多種類型,但是其創(chuàng)傷愈合的過程十分類似主要包括炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生、組織的再生、瘢痕組織形成等階段。對(duì)于輕度的創(chuàng)傷僅限于皮膚表皮層可通過上皮再生完成愈合過程,但是對(duì)于較嚴(yán)重的伴有皮膚和皮下組織斷裂的較大傷口,以及伴有感染和各種全身性疾病的難愈合傷口,通常需要人工干預(yù)治療,如各種細(xì)胞因子的應(yīng)用、各種輔料的使用,以及皮膚修補(bǔ)及植皮等方式。而且皮膚附屬器(毛囊、汗腺及皮脂腺)如遭完全破壞,則不能完全再生,而出現(xiàn)瘢痕修復(fù)。隨著基礎(chǔ)研究的深入和生物材料技術(shù)的進(jìn)步,越來越多細(xì)胞因子的作用機(jī)制得以闡述并在臨床應(yīng)用,生物材料也在傷口部位使用預(yù)防感染和體液的流失,使得目前創(chuàng)傷的治療具有更多的治療手段和較好的療效,但是依然不能滿足臨床的需求,不能解決附屬器官再生問題和創(chuàng)傷愈合信號(hào)機(jī)制問題。Activin B是TGFβ超家族成員之一,我們前期研究發(fā)現(xiàn)Activin B通過調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的重組促進(jìn)其遷移,本研究首先在在體水平探討Activin B在創(chuàng)傷愈合過程中的作用,并進(jìn)一步探討其信號(hào)機(jī)制；其次探討經(jīng)過溫敏分子修飾的水凝膠對(duì)傷口愈合的作用,其可以根據(jù)溫度的變化呈現(xiàn)不同的狀態(tài),低于33℃是其呈液態(tài),高于33℃時(shí)呈膠狀,根據(jù)這一特性,其可以滿足不同形態(tài)傷口的需求,本研究將為其在創(chuàng)傷愈合的進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)。第一章RhoA-Rock-JNK-cJun信號(hào)通路介導(dǎo)Activin B促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合研究背景和目的皮膚創(chuàng)傷愈合包括表皮和真皮的再生,表皮的再生過程中最重要的事件之一是：傷口周圍的上皮及附屬結(jié)構(gòu)的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移至創(chuàng)面,在遷移過程中細(xì)胞發(fā)生一系列表型的改變；其次是緊隨發(fā)生的細(xì)胞增殖活動(dòng),角質(zhì)形成細(xì)胞受到創(chuàng)傷事件中細(xì)胞因子或者物理化學(xué)信號(hào)后通過遷移、增殖形成新生表皮的過程即是皮膚再上皮化(re-epithelialization) 。皮膚創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域有兩大核心問題：一是創(chuàng)面愈合的速度問題,二是創(chuàng)面愈合的質(zhì)量問題。創(chuàng)面的快速愈合,能減少傷口的感染和減輕增生性瘢痕的形成,因此探索如何能促進(jìn)傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移增殖問題是解決傷口愈合的關(guān)鍵之處。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)在In vitro水平活化素B (Activin B)通過調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的重組促進(jìn)細(xì)胞的遷移,這一現(xiàn)象依賴于RhoA-JNK和MEKK1-p38信號(hào)通路,這一發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步在In vivo水平探索傷口愈合的研究提供基礎(chǔ)。Activin B是轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor β, TGF β)超家族成員,目前Activin B作用于其相應(yīng)受體而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),卵泡抑素(follistatin)是activin的拮抗劑,為可溶性蛋白,卵泡抑素可以與Activin B結(jié)合,通過抑制activin B與其受體的結(jié)合而抑制Activin B的生物學(xué)效應(yīng)。RhoA屬于Rho家族成員之一,JNK, p38信號(hào)屬于絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)家族成員,是介導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)答的重要信號(hào)系統(tǒng),采用高度保守的三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)傳遞信號(hào)。結(jié)合前期研究成果我們提出以下問題：In vivo水平Activin B能否促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移從而加速創(chuàng)傷的愈合?繼而探討參與皮膚創(chuàng)傷愈合過程相應(yīng)的信號(hào)途徑?研究方法1.創(chuàng)傷模型：昆明KM小鼠,背部左側(cè)制作0.5cm × 0.5cm的正方形切口；2.分組：PBS組,Activin B組,Plenti6/v5-EGFP組,Plenti6/v5-EGFP-RhoAL63組;Plenti6/v5-RhoAN19組;Y27632組；Plenti6/v5-EGFP+Activin B組,Plenti6/v5-EGFP-RhoAL63+Activin B組；Plenti6/v5-RhoAN19+Activin B組,Activin B+Y27632組；Activin B+SP600125組；SP600125組；Plenti6/v5-EGFP-RhoAL63+SP600125+Activin B組;Plenti6/v5-EGFP+ SP600125+Activin B組;Activin B+Follistatin組;Follistatin組。3.檢測指標(biāo)：(1)組織形態(tài)：術(shù)后第3天,5天,7天記錄傷口面積,計(jì)算傷口愈合率；HE染色觀察傷口再上皮化；掃描電鏡和透射電鏡觀察創(chuàng)傷愈合超微結(jié)構(gòu)的變化;(2)信號(hào)機(jī)制：免疫組化檢測BrdU標(biāo)記傷口周圍細(xì)胞增殖;Western Blotting和免疫組化檢測傷口愈合過程中JNK, Rock, ERK, p38和p-JNK, p-ERK, p-p38, p-cJun蛋白激酶的磷酸化活性。研究結(jié)果：1.傷口愈合率：結(jié)果發(fā)現(xiàn)in vivo水平Activin B顯著促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化,提高傷口愈合(與PBS組相比,F=359.810,P0.001)；2.組織形態(tài)觀察：Activin B促進(jìn)傷口周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移至傷口部位,術(shù)后第3天、第5天Activin B組傷口周圍上皮角質(zhì)形成細(xì)胞層數(shù)多于PBS組,術(shù)后第6天再上皮化已經(jīng)完成,而且發(fā)現(xiàn)毛囊的再生。而PBS組術(shù)后第6天傷口部分尚未完成再上皮化；掃描電鏡和透射電鏡發(fā)現(xiàn)：Activin B組術(shù)后第3天傷口愈合部位可見再上皮化的新生上皮和沿膠原爬行的大量角質(zhì)形成細(xì)胞,PBS組術(shù)后第3天傷口愈合表面部位也可見再上皮化的新生上皮,愈合部位橫切面角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量低于Activin B組；術(shù)后第5天PBS組基底層細(xì)胞間連接比Activin B組細(xì)胞間連接緊密,提示Activin B組基底細(xì)胞更具有爬行的能力,認(rèn)為Activin B在in vivo水平上促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移。3.信號(hào)事件：免疫組化BrdU檢測發(fā)現(xiàn)Activin B促進(jìn)傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖；Plenti6/v5-EGFP-RhoA L63可以進(jìn)一步提高傷口愈合率,免疫組織化學(xué)和WB檢測發(fā)現(xiàn)Activin B促進(jìn)JNK和cJun的磷酸化活化,以上結(jié)果提示RhoA、 JNK和cJun參與Activin B促進(jìn)傷口愈合這一過程；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Plenti6/v5-EGFP-RhoAN19, Rock抑制劑(Y27632), JNK抑制劑(SP600125)以及Follistatin可以抑制Activin B引起的傷口快速再上皮化和傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,以上研究結(jié)果說明Activin B促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合這一現(xiàn)象是由RhoA-Rock-JNK-cJun信號(hào)通路介導(dǎo)。研究結(jié)論Activin B促進(jìn)傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增殖完成再上皮化過程,而這一現(xiàn)象是由通過RhoA-Rock-JNK-cJun信號(hào)通路介導(dǎo)的。第二章溫敏水凝膠促進(jìn)皮膚傷口愈合研究背景和目的皮膚是人體最大的器官,總重量占體重的5%-15%,總面積為1.5-2平方米,其首要功能是將機(jī)體組織隔絕外界環(huán)境起到保護(hù)屏障的作用。同時(shí),由于創(chuàng)傷、燒傷、感染、腫瘤和代謝疾病等造成的皮膚損傷在臨床上十分常見。治療皮膚缺損的關(guān)鍵是使創(chuàng)面盡早封閉,減少機(jī)體消耗和內(nèi)環(huán)境紊亂,以及微生物入侵等并發(fā)癥的發(fā)生。對(duì)于較大的傷口創(chuàng)面不能盡快實(shí)現(xiàn)封閉和自體快速愈合,因此生物材料支架以及生物材料支架復(fù)合細(xì)胞因子和種子細(xì)胞得以應(yīng)用。目前應(yīng)用較多的是各種預(yù)成型支架材料和水凝膠,相對(duì)于預(yù)成型支架材料,水凝膠具有很多優(yōu)點(diǎn)：初始的溶膠／細(xì)胞懸液可填充任意形狀的缺損,且能與各種治療藥物混合,植入時(shí)不需外科手術(shù)。因此原位形成凝膠在組織工程中有廣泛的應(yīng)用前景。水凝膠材料可以依據(jù)其修飾分子的不同分不同的類型,溫敏水凝膠是具有對(duì)溫度敏感的水凝膠,其具有最低臨界共溶溫度(Lower critical solution temperature, LCST),在LCST附近體積會(huì)突然收縮或膨脹,即發(fā)生溶膠相到收縮相的體積轉(zhuǎn)變,即(液態(tài)和固態(tài)的轉(zhuǎn)化)。本研究將對(duì)經(jīng)過特殊修飾的溫敏水凝膠(加拿大曼尼托巴大學(xué)邢孟秋教授提供)首先在小鼠創(chuàng)傷模型上探討修飾后的溫敏水凝膠其對(duì)傷口愈合過程的作用。傷口愈合過程中主要的生物學(xué)事件：炎癥反應(yīng)(主要巨噬細(xì)胞)、肉芽組織增生(血管新生,成纖維細(xì)胞增殖)、角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移、收口收縮和膠原的產(chǎn)生和降解等,本研究針對(duì)以上生物學(xué)事件研究溫敏水凝膠的作用。研究方法1.創(chuàng)傷模型：C57BL/6小鼠,背部左側(cè)制作lcm× 1cm的正方形切口；2.分組：Control組,Hydrogel-3組,Hydrogel-1組;3.檢測指標(biāo)：(1)組織形態(tài)：術(shù)后第0-7天,記錄傷口面積,計(jì)算傷口愈合率；HE染色觀察傷口再上皮化；(2)巨噬細(xì)胞浸潤：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；(3)肉芽組織內(nèi)周細(xì)胞的數(shù)量：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測周細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；(4)肉芽組織內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；(5)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的進(jìn)入增殖狀態(tài)標(biāo)記物K6的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；(6)膠原的染色：術(shù)后第5天、第7天和第14天取材,石蠟切片,Masson三色染色檢測傷口部位膠原的表達(dá)。研究結(jié)果：1.創(chuàng)傷愈合率：結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫敏水凝膠顯著提高傷口愈合率(與PBS組相比,F=316.230,P0.001);2.組織形態(tài)觀察：在光鏡水平觀察傷口再上皮化過程,術(shù)后第3天,第5天和第7天分別取傷口周圍0.5cm范圍內(nèi)的組織,HE染色發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3天Hydrogel-3和Hydrogel-1組傷口邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞增殖明顯且已經(jīng)開始向傷口中心遷移形成上皮帶(即再上皮化),Control組僅在傷口周圍出現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞反應(yīng)增殖,遷移形成上皮帶并不明顯。術(shù)后第5天Hydrogel-3和Hydrogel-1組傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞增殖形成細(xì)胞層數(shù)更多,遷移速度即(再上皮化速度)快于Control組,術(shù)后第7天Hydrogel-1組傷口已經(jīng)完成再上皮化,Hydrogel-3組傷口部位大部分已經(jīng)完成再上皮化,該結(jié)果提示Hydrogel促進(jìn)傷口收縮的同時(shí)促進(jìn)傷口再上皮化。3.檢測指標(biāo)：(1)巨噬細(xì)胞浸潤：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Hydrogel促進(jìn)巨噬細(xì)胞的浸潤；(2)肉芽組織內(nèi)周細(xì)胞的數(shù)量：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Hydrogel促進(jìn)周細(xì)胞的產(chǎn)生；(3)肉芽組織內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Hydrogel組肌成纖維細(xì)胞數(shù)量較Control組多(F=190.303,P0.001),提示：Hydrogel可通過肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)傷口的收縮；(4)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖：術(shù)后第3天和第5天取材,石蠟切片,免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Hydrogel促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移；(5)膠原的染色：術(shù)后第5天、第7天和第14天取材,石蠟切片,Masson三色染色檢測發(fā)現(xiàn)Hydrogel促進(jìn)膠原的生成和降解。研究結(jié)論溫敏水凝膠調(diào)節(jié)創(chuàng)傷過程中炎癥反應(yīng)促進(jìn)傷口收縮進(jìn)而促進(jìn)傷口的快速再上皮化。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R641

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1 張敏;Activin B在皮膚創(chuàng)傷的信號(hào)機(jī)制和溫敏水凝膠在皮膚創(chuàng)傷的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2385617