【摘要】：[研究背景及目的] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染在發(fā)展中國家和亞太地區(qū)的流行情況非常嚴重,我國亦是HBV感染高發(fā)地區(qū),人群攜帶率約10%,由HBV引起的暴發(fā)性肝衰竭(fulminant hepatic failure, FHF)和慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF),其病情兇險,死亡率高達70%以上,臨床上缺乏特異而有效的治療靶點和干預手段,除非實施肝移植,絕大部分患者預后不良。病毒誘導的肝衰竭的發(fā)病機制十分復雜,近年來我們對Ⅲ型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain3, MHV-3)誘導的小鼠暴發(fā)型肝衰竭和HBV誘導的慢加急性肝衰竭(HBV-induced acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)進行研究中證實,NK細胞與肝衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關。肝臟中含有豐富的NK細胞,其作為機體天然免疫的第一道防線發(fā)揮著至關重要的作用。此外NK細胞還具有調(diào)節(jié)肝臟損傷,募集外周血淋巴細胞等功能。近期研究證實,在小鼠肝炎模型、感染HBV以及HCV的患者體內(nèi),NK細胞均能介導肝損傷。在MHV-3誘導的小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型以及小鼠巨細胞(MCMV)模型中,NK細胞可以大量殺傷被病毒感染的肝臟細胞。Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,NK細胞在肝臟迅速大量募集和活化,且殺傷活性顯著增強,分泌IFN-γ和TNF-α的水平也顯著上調(diào),而且可通過Fas-FasL和NKG2D-NKG2DL途徑損傷肝細胞,表明肝臟NK細胞在MHV-3誘導的小鼠暴發(fā)性肝衰竭中可能發(fā)揮重要作用。但是,在天然免疫階段,機體如何調(diào)劑NK細胞,特別是如何抑制NK細胞的活性的免疫學機制尚不清楚。 髓源性抑制細胞(MDSCs)是一種骨髓細胞,具有高度的異質(zhì)性。并且由于其最初發(fā)現(xiàn)時具有免疫抑制性,因此而得名。在病理條件下,如癌癥、急性和慢性感染、創(chuàng)傷、創(chuàng)傷后應激、移植、糖尿病、以及一些自身免疫性疾病等條件下,MDSCs可以大量增殖,并且迅速進入外周血,并最終募集于相應的靶器官以及組織中。小鼠MDSC細胞可以用CD11b+Gr-1+作為標示。已有研究證實,該群細胞可以抑制T細胞的增殖,抑制T細胞的活化。但是并不是所有的MDSCs細胞均表現(xiàn)為免疫抑制性,已有研究證實在肝臟疾病模型中,LY6C+MDSCs可以激活NK細胞表達活化性受體NKG2D。表達CD11b+Gr-1+的細胞也并不完全等價于MDSCs,他還包括成熟的中性粒細胞,炎癥單核細胞,腫瘤壞死因子以及誘導型一氧化氮合酶介導的DC細胞(Tip-DC).現(xiàn)有研究證實,部分MDSCs不是簡單的被激活的炎性單核細胞或者中性粒細胞的前體,而是具有強大免疫抑制性的特殊免疫調(diào)節(jié)性細胞。MDSCs在適應性免疫階段對T細胞活性的抑制已經(jīng)得到了廣泛的實驗論證。其主要的機制為依賴精氨酸酶-1,環(huán)氧化酶-2,前列腺素E2,NO(一氧化氮),活性氧(ROS)的上調(diào)介導對T細胞活性的抑制。另外,可以通過產(chǎn)生生長轉(zhuǎn)化因子-β(TGF-β)以及耗竭半胱氨酸,調(diào)節(jié)T細胞表面L型受體的表達等途徑抑制T細胞的活性。 另外,有研究證實,在天然免疫階段,MDSCs可以調(diào)節(jié)NK細胞的免疫學活性。在荷瘤小鼠模型中,MDSCs可以抑制NK細胞分泌能夠殺傷腫瘤細胞的細胞因子。除此以外,MDSC細胞可以抑制NK細胞分泌IFN-γ,以此達到抑制NK細胞活性的目的。而上述免疫抑制功能,均需依靠細胞-細胞相互接觸完成。另外有研究表明,表達CD11b+Gr-1+F4/80+的MDSCs可以抑制NKT細胞的活性,另外可以通過表達RAE-1(維甲酸早期誘導因子-1),激活NK細胞。 已有文獻很少有提及在病毒感染狀態(tài)下,MDSCs對NK細胞的免疫調(diào)節(jié)以及其相應的機制。本實驗從體內(nèi)、體外兩方面闡述在MHV-3誘導的小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型中,MDSCs中LY6G+細胞亞群對NK細胞活性的抑制作用以及作用機制。另外對MDSCs的另一亞群LY6Gneg細胞對NK細胞的活化作用做了簡單的探討。并且對于ICAM-1與CDllb之間的相互作用導致NK細胞以及MDSCs在肝臟中的募集機制做了一定的研究。 具體研究目標如下： 1.建立小鼠暴發(fā)性肝炎模型 ①在疾病進程中動態(tài)觀察小鼠骨髓,外周血,肝臟,脾臟內(nèi)MDSCs的分布。 ②研究肝臟MDSCs的分群 ③研究MDSCs LY6Ghi亞群對NK細胞的免疫抑制性作用。 ④研究MDSCs LY6neg亞群對NK細胞的活化作用。 2.探討NK細胞以及MDSCs在肝臟中的募集機制 動態(tài)觀察肝臟細胞ICAM-1的表達以及NK細胞、MDSC細胞CDllb的表達。 [研究方法] 1.采用MHV-3腹腔途徑感染Balb/cJ小鼠建立暴發(fā)性肝衰竭模型。 2.流式細胞術(shù)檢測MHV-3感染0、24、48、72h后的Balb/cJ小鼠肝臟、脾臟、外周血和骨髓中MDSCs的相對數(shù)量(MDSC/MNC)。 3.多色流式細胞術(shù)檢測感染MHV-3前后,肝臟中MDSCs的分群,以及其分群特點。 4.體外共培養(yǎng)條件下MDSCs LY6Ghi亞群對NK細胞的抑制性作用。檢測NK細胞共培養(yǎng)后NKG2D(MFI)的表達,INF-y的分泌以及對YAC-1細胞的殺傷能力。通過抗體阻斷的方式,研究LY6Ghi MDSCs對NK細胞的抑制性機制。 5.用細胞過繼實驗以及抗體阻斷實驗,觀察在體內(nèi)環(huán)境下MDSCs對NK細胞活性的影響,以及觀察小鼠的生存曲線。 6.在體外共培養(yǎng)的條件下MDSCs LY6Ghi亞群對NK細胞的活化性作用。檢測NK細胞共培養(yǎng)后NKG2D(MFI)的表達,INF-y的分泌以及對YAC-1細胞的殺傷能力。檢測LY6Ghi MDSCs RAE-1的表達。 7.流式細胞術(shù)檢測感染MHV-3前后(48h)小鼠肝臟細胞ICAM-1的表達情況。檢測NK細胞以及MDSCs CDllb的表達情況。 8.在體內(nèi)環(huán)境下,用抗體阻斷的方法阻斷ICAM-1,觀察小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型的生存曲線,以及感染病毒48h肝臟病理變化。 [實驗結(jié)果] 1.在正常小鼠肝臟內(nèi),MDSCs分為2個亞群即：Ly6Chi Ly6Gneg MDSCs亞群以及Ly6Cint Ly6Gneg MDSCs亞群。在感染MHV-348小時,小鼠肝臟MDSCs明顯分為3個亞群：Ly6Chi Ly6Gneg MDSCs亞群,Ly6Cint Ly6Gneg MDSCs亞群,Ly6Cint LY6Ghi MDSCs亞群.Ly6Cint Ly6Ghi MDSCs具有SSChi(較高的側(cè)向散射)這一特性,并且具有環(huán)狀核即分葉核。Ly6Cint Ly6Gneg MDSCs具有SSCint特性,Ly6Chi Ly6Gneg MDSCs具有SSClow特性。這兩亞群細胞更具有淋巴細胞不分葉核這一特性。 2.在感染MHV-3病毒48小時后,小鼠外周血、脾臟、骨髓的單個核細胞中MDSCs的比例發(fā)生變化,即表達CD11b+Gr-1+細胞相對數(shù)量發(fā)生變化。在外周血中,由30.7%上升至45.7%。在脾臟中,由16.5%下降至9.7%。在骨髓中,由63.7%下降至38.4%。 3.在體外條件下將取自正常小鼠肝臟的NK細胞與感染48小時MHV--3小鼠肝臟的LY6G hi MDSCs共培養(yǎng)12小時,NK細胞表達NKG2D(MFI)降低,分泌IFN-γ減少,對YAC-1細胞的殺傷作用均降低。用Transwell,抗體阻斷方法,證實,LY6Ghi MDSCs對NK細胞的抑制性作用是通過非細胞-細胞接觸式,并且依賴TGF-β以及NO途徑。 4.在體內(nèi)用Gr-1抗體阻斷,以及LY6Ghi MDSCs過繼方法證實。正常小鼠過繼LY6Ghi MDSCs后,小鼠肝臟NK細胞表達NKG2D (MFI)下降。且過繼LY6Ghi MDSCs,抗體阻斷Gr-1均可以延長小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型小鼠的生存時間。 5.在體外條件下將取自正常小鼠肝臟的NK細胞與感染48小時MHV-3小鼠肝臟LY6c細胞共培養(yǎng)12小時。NK細胞表達NKG2D(MFI)上升。且流式細胞學檢測,小鼠感染MHV-3,48小時后,LY6Cint-hi LY6GnegMDSCs表達RAE-1上升。 6.流式細胞學檢測感染MHV-348h后,小鼠肝臟細胞ICAM-1(MFI)上升。小鼠肝臟NK細胞,LY6Ghi MDSC細胞表達CD11b(MFI)上升。抗體阻斷小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型小鼠ICAM-1,小鼠生存時間延長。 [結(jié)論] 1、本研究首次利用MHV-3誘導的暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型探討了肝臟MDSCs在病毒誘導的肝衰竭中作用。著重探討了MDSC細胞亞群LY6Ghi MDSCs對NK細胞的免疫學抑制作用。 2、本研究首次在MHV-3誘導小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型中,感染小鼠肝臟內(nèi)MDSCs的分群以及細胞動力學改變。 3、研究發(fā)現(xiàn),Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,MDSCs在肝臟迅速大量募集。其中LY6Ghi MDSCs亞群,可以通過TGF-p以及NO途徑抑制NK細胞表達NKG2D以及分泌IFN-y,抑制NK細胞的殺傷作用。另外LY6Cint-hi LY6Gneg MDSCs可以通過RAE-1途徑,激活NK細胞表達NKG2D(MFI)。上述實驗表明肝臟MDSCs在MHV-3誘導的小鼠暴發(fā)性肝衰竭中可能發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用。這一研究發(fā)現(xiàn)有助于深入理解病毒誘的暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機制,亦為后續(xù)疾病的干預治療提供了新的契機。 4、本研究進一步利用MHV-3誘導的暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型探討了肝臟MDSCs以及NK細胞遷移的分子機制,探討了ICAM-1, CDllb趨化受體-配體模式的作用,為后續(xù)疾病的分子干預治療提供了重要的靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R575.3

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