【摘要】：研究背景： 創(chuàng)面愈合是皮膚出現(xiàn)缺損后，局部組織通過遷移、增殖、重塑，進(jìn)行修復(fù)的病理生理過程。這一過程需要各種修復(fù)細(xì)胞與一系列細(xì)胞因子的相互作用來調(diào)控，其中成纖維細(xì)胞是重構(gòu)真皮的主要效應(yīng)細(xì)胞。因此，發(fā)生在成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）之間的大量復(fù)雜的生物反應(yīng)是研究傷口愈合病理過程的重要部分。 ECM作用于細(xì)胞膜的主要受體是整合素，研究表明傷口愈合過程中會(huì)出現(xiàn)多種整合素表達(dá)增強(qiáng)，推測(cè)整合素可能參與創(chuàng)傷愈合過程的調(diào)控。整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）連接整合素胞內(nèi)結(jié)構(gòu)并促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明利用小分子干擾技術(shù)（siRNA）下調(diào)ILK蛋白的表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和惡化。另外，有研究發(fā)現(xiàn)ILK在轉(zhuǎn)化生長因子β1（transformationgrowth factor beta1，TGF-β1）誘導(dǎo)小鼠腎臟纖維化進(jìn)程中起重要作用。創(chuàng)面愈合肉芽組織形成的病理特征也是ECM沉積和成纖維細(xì)胞分化增生。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合與ILK的表達(dá)密切相關(guān)，但對(duì)ILK在創(chuàng)面愈合的作用和影響機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。 根據(jù)ILK蛋白氨基酸排列的特點(diǎn)，人工合成的蛋白小分子QLT0267能與胞漿中的ILK特異性結(jié)合并阻斷其Ser473磷酸化位點(diǎn)，抑制其對(duì)蛋白激酶B（PKB/AKT）的磷酸化，降低磷酸化AKT（phosphorylation of AKT，pAKT）的量，調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)改變。研究發(fā)現(xiàn)ILK特異性阻斷劑QLT0267能有效地降低pAKT的蛋白量，影響腫瘤細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞的遷移、分化增生和凋亡，推論ILK通過ILK-PKB/AKT途徑調(diào)控細(xì)胞生理功能。ILK特異性抑制劑QLT0267的應(yīng)用為研究ILK在創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制提供了新的方向。 本研究以人皮膚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用QLT0267抑制ILK磷酸化AKT；同時(shí)利用siRNA技術(shù)降低ILK蛋白的表達(dá)，，觀察成纖維細(xì)胞的遷移和分化功能的改變，初步探討ILK在創(chuàng)面愈合過程中的作用。 第一部分不同濃度ILK特異性抑制劑QLT0267對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的影響 目的觀察不同濃度的ILK特異性抑制劑QLT0267在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)成纖維細(xì)胞生物學(xué)特征的改變，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳藥物濃度及觀察時(shí)間點(diǎn)。 方法收集整形術(shù)后剩余的皮膚標(biāo)本，采用機(jī)械法加酶消化法分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，利用ILK特異性抑制劑QLT0267降低ｐAKT的量，以不同終濃度藥物作用于成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為A空白對(duì)照組、B5nM QLT0267組、C10nMQLT0267組、D20nM QLT0267組、E30nM QLT0267組和F DMSO組（QLT0267溶劑）。分別于12、24、48、72h在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；CellTiter試劑盒檢測(cè)24、48、72h時(shí)間點(diǎn)各組的增殖情況，并與空白對(duì)照組比較計(jì)算增殖抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)48h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)Western Blot法觀察pAKT、tAKT蛋白的表達(dá)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析檢驗(yàn)。 結(jié)果經(jīng)濃度大于10nM的ILK特異性抑制劑作用下成纖維細(xì)胞膨脹變圓，核固縮或破碎，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，隨藥物刺激時(shí)間的延長和藥物濃度的增加，改變更加明顯。CellTiter試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示10nM以上的ILK特異性抑制劑QLT0267能抑制成纖維細(xì)胞的增殖（P＜0.05），且隨著濃度的增高和刺激時(shí)間的延長，增殖抑制率也提高（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比較，10nM以上的ILK特異性抑制劑能誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。Western Blot結(jié)果顯示各藥物濃度組的pAKT表達(dá)比空白對(duì)照組低，并隨著藥物濃度的上升而下降（P＜0.05）。各組成纖維細(xì)胞表達(dá)tAKT蛋白量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。 結(jié)論ILK特異性抑制劑QLT0267能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，通過降低pAKT的量而抑制細(xì)胞增殖、啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。隨著藥物濃度的升高和刺激時(shí)間的延長，效果更明顯。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)用10nMQLT0267成纖維細(xì)胞刺激48h是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳實(shí)驗(yàn)條件。 第二部分ILK對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞遷移能力的影響 目的探討ILK影響人皮膚成纖維細(xì)胞遷移能力的作用機(jī)制。 方法體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，設(shè)計(jì)及合成靶向ILK基因的siRNA序列，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)ILK-siRNA轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞以及采用終濃度為10nM ILK特異性抑制劑QLT0267刺激細(xì)胞48h。實(shí)驗(yàn)分為以下6組：A空白對(duì)照組、B轉(zhuǎn)染載體組（Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑）、C con-siRNA組、DILK-siRNA組、E ILK活性抑制組和F DMSO組（QLT0267溶劑）。以上各組行體外細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，目鏡下觀察劃痕后0、12、24h時(shí)間點(diǎn)各組成纖維細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移的面積，計(jì)算細(xì)胞愈合率；RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞ILKmRNA的表達(dá)；Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞ILK、 pAKT、tAKT蛋白的表達(dá)。對(duì)數(shù)據(jù)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。 結(jié)果體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示劃痕12h后ILK-siRNA組和ILK活性抑制組細(xì)胞愈合率顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），兩組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較，通過小分子干擾能顯著地抑制ILK基因的表達(dá)（P＜0.01）。Western Blot結(jié)果顯示ILK-siRNA組ILK表達(dá)比其余各組顯著降低（P＜0.01）；ILK-siRNA組與ILK活性抑制組的pAKT表達(dá)比其余各組降低（P＜0.05），兩組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；tAKT的表達(dá)各組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。 結(jié)論應(yīng)用小分子干擾技術(shù)能下調(diào)ILK蛋白的表達(dá)下調(diào)，而ILK蛋白的降低或磷酸化活性被抑制，均能降低pAKT蛋白的表達(dá)量。結(jié)合體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推論ILK可能通過ILK-AKT途徑影響成纖維細(xì)胞的遷移功能。 第三部分ILK對(duì)TGF-β1刺激人皮膚成纖維細(xì)胞上調(diào)α肌動(dòng)蛋白的影響 目的探討ILK對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成α-肌動(dòng)蛋白（alpha-smoothmuscle actin，α-SMA）的影響，探討ILK在成纖維細(xì)胞分化過程的作用。 方法實(shí)驗(yàn)分為以下6組：A空白對(duì)照組、B轉(zhuǎn)染載體組（Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑）、C con-siRNA組、D ILK-siRNA組、E ILK活性抑制組和F DMSO組（QLT0267溶劑）。Western Blot檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)。再取常規(guī)培養(yǎng)成纖維細(xì)胞分為以下7組：1. TGF-β1組、2.轉(zhuǎn)染載體+TGF-β1組、3.con-siRNA+TGF-β1組、4. ILK-siRNA+TGF-β1組、5. ILK活性抑制+TGF-β1組、6. DMSO+TGF-β1組、7.空白對(duì)照組。應(yīng)用小分子干擾沉默ILK蛋白表達(dá)以及利用ILK特異性抑制劑QLT0267抑制ILK磷酸化活性，按第二部實(shí)驗(yàn)分組方法處理1~6組后，再用5ng/ml TGF-β1加入1~6組刺激24h，Western Blot檢測(cè)各組α-SMA、ILK蛋白的改變。數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。 結(jié)果ILK-siRNA組和ILK活性抑制組的α-SMA蛋白比空白對(duì)照組明顯低（P0.05），兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TGF-β1組的α-SMA比空白對(duì)照組有所上升（P0.05）。ILK-siRNA+TGF-β1組的ILK比TGF-β1組低（P0.05）。ILK-siRNA+TGF-β1組和ILK活性抑制+TGF-β1組的α-SMA蛋白比TGF-β1組低（P0.05），兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論ILK蛋白下調(diào)或其磷酸化活性受限能降低成纖維細(xì)胞合成α-SMA蛋白。TGF-β1可刺激成纖維細(xì)胞加快向肌成纖維細(xì)胞方向分化，但I(xiàn)LK表達(dá)下調(diào)或ILK活性受抑制均可減弱其刺激成纖維細(xì)胞分化的作用，推斷ILK通過參與TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分化而影響創(chuàng)面愈合的效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R641

【參考文獻(xiàn)】

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1 李罡;李葉揚(yáng);米蘭;孫敬恩;潘姝;戴麗冰;;整合素連接激酶和β_1整合素在大鼠燙傷創(chuàng)面愈合過程中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2009年04期

本文編號(hào)：2306987