【摘要】：肝硬化對(duì)人類健康仍然是一個(gè)巨大的威脅。對(duì)于失代償期肝硬化，原位肝移植是唯一能夠延長(zhǎng)患者生存期的治療方法，但供肝缺乏、費(fèi)用高昂等因素嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái)，干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得了一系列重要進(jìn)展。大量研究表明，成體干細(xì)胞具有可塑性、能夠被誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞。臨床探索性研究發(fā)現(xiàn)，，自體干細(xì)胞移植能夠有效地促進(jìn)肝臟疾病的恢復(fù)。 目前用于肝臟疾病治療的干細(xì)胞主要包括骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs)、造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs)及未分類的混合細(xì)胞�；A(chǔ)與臨床研究表明，MSCs和HSCs都能改善肝損傷、促進(jìn)肝功能恢復(fù)，但目前尚不清楚哪一種干細(xì)胞效果更好。此外，干細(xì)胞治療骨損傷、糖尿病和心臟病的研究提示，MSCs和HSCs可能具有一定的協(xié)同作用。但在干細(xì)胞促進(jìn)肝損傷恢復(fù)的過(guò)程中，MSCs和HSCs是否發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)仍未見(jiàn)報(bào)道。 本研究擬采用綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）轉(zhuǎn)基因雄性小鼠分離純化MSCs和HSCs，將這些細(xì)胞單一和兩者組合之后移植給同品系肝損傷雌性小鼠（CCl_4肝損傷模型，不表達(dá)GFP），進(jìn)而對(duì)比觀察兩種干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的示蹤及其促進(jìn)肝損傷修復(fù)的作用與機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、觀察骨髓來(lái)源的MSCs和HSCs移植后在肝損傷小鼠體內(nèi)的分布，比較兩種干細(xì)胞向損傷肝臟歸巢的能力； 2、對(duì)比分析骨髓來(lái)源的MSCs和HSCs促進(jìn)小鼠肝損傷恢復(fù)的效果，觀察MSCs和HSCs有無(wú)協(xié)同作用； 3、初步明確MSCs和HSCs促進(jìn)小鼠肝損傷恢復(fù)的機(jī)制。材料和方法 1、取GFP轉(zhuǎn)基因小鼠（雄性小鼠）的骨髓，利用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離MSCs，利用流式分選技術(shù)分離純化HSCs； 2、借助細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和成骨成脂誘導(dǎo)等方法對(duì)分離的干細(xì)胞進(jìn)行表型和功能鑒定； 3、用CCl_4制備肝損傷小鼠模型（雌性小鼠）。將正常小鼠或肝損傷小鼠隨機(jī)分為五組，一組接受MSCs回輸，一組接受HSCs回輸，一組接受MSCs和HSCs混合細(xì)胞回輸（按1:1比例），一組作為空白對(duì)照，一組作為模型對(duì)照組，每只小鼠接受的細(xì)胞數(shù)量為1x106； 4、通過(guò)小動(dòng)物熒光成像技術(shù)、熒光細(xì)胞示蹤和PCR檢測(cè)Y染色體序列等技術(shù)，比較移植的干細(xì)胞在小鼠各個(gè)主要臟器的分布，觀察干細(xì)胞向損傷肝臟的歸巢能力； 5、通過(guò)生存分析、肝組織HE染色及血清學(xué)檢查等方法比較MSCs和HSCs促進(jìn)肝損傷修復(fù)的效果； 6、通過(guò)苦味酸天狼星紅染色、免疫組織化學(xué)染色和Real-time PCR等方法，檢測(cè)干細(xì)胞移植對(duì)小鼠肝纖維化及纖維化相關(guān)分子表達(dá)的影響； 7、借助激光共聚焦顯微鏡觀察干細(xì)胞在損傷肝臟中的定植； 8、通過(guò)免疫組化和免疫熒光染色等方法，觀察干細(xì)胞移植對(duì)肝細(xì)胞再生能力的影響； 9、通過(guò)ELISA方法檢測(cè)干細(xì)胞移植對(duì)小鼠體內(nèi)多種生長(zhǎng)因子及免疫因子的影響。 結(jié)果 1、分離鑒定GFP小鼠骨髓來(lái)源的MSCs及HSCs 用全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功分離出MSCs。第一代的MSCs在顯微鏡下表現(xiàn)為形狀不規(guī)則的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞熒光強(qiáng)度不均勻。當(dāng)體外培養(yǎng)至第三代時(shí)，MSC細(xì)胞大小及形狀較規(guī)則，熒光強(qiáng)度也較均勻。絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD90(95.2±6.1%)、CD29(85.6±3.5%)、CD105(96.5±4.3%)、CD45(6.3±2.2%)、CD34(7.2±1.8%)和CD80(3.8±1.2%)，符合MSCs表型。功能試驗(yàn)顯示，MSCs可向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化。提示我們成功獲得了MSCs。同時(shí)，我們采用流式細(xì)胞術(shù)成功分選獲得了HSCs。 2、MSCs和HSCs的體內(nèi)示蹤 當(dāng)把MSCs、HSCs及兩者等比例混合的細(xì)胞（MSCs+HSCs）通過(guò)尾靜脈注入肝損傷小鼠或正常小鼠，GFP信號(hào)首先在小鼠肺內(nèi)蓄積，2h后GFP信號(hào)在肺內(nèi)開(kāi)始逐漸減弱，之后開(kāi)始在肝臟和脾臟中蓄積。在接下來(lái)的觀察時(shí)間內(nèi)GFP信號(hào)強(qiáng)度在肝臟中一直保持增長(zhǎng)趨勢(shì)，然而脾中的信號(hào)強(qiáng)度從7d開(kāi)始減弱。腎臟中的GFP信號(hào)強(qiáng)度幾乎檢測(cè)不到。三組中GFP強(qiáng)度變化趨勢(shì)一致。肝臟中的GFP信號(hào)在MSCs組較HSCs組及MSCs+HSCs組顯著增強(qiáng)，提示MSCs較HSCs向損傷肝臟的歸巢能力更強(qiáng)。此外，無(wú)論是MSCs還是HSCs，在4w時(shí)在肝臟中的蓄積都比2w時(shí)要多。Y染色體示蹤的結(jié)果與GFP示蹤結(jié)果相似。 與接受干細(xì)胞的正常小鼠相比，在所有的觀察點(diǎn)上，肝損傷小鼠肝臟內(nèi)的GFP信號(hào)均顯著增強(qiáng)，提示肝損傷是誘導(dǎo)干細(xì)胞向肝臟歸巢的重要因素。 流式細(xì)胞術(shù)分析及Real-Time PCR發(fā)現(xiàn)，MSC（培養(yǎng)至第三代時(shí)）上的CXCR4（干細(xì)胞的歸巢受體）表達(dá)量顯著高于HSC。 3、MSCs和HSCs促進(jìn)肝損傷修復(fù)效果的對(duì)比 制備肝損傷小鼠模型，并使用MSCs、HSCs或兩者等比例混合細(xì)胞進(jìn)行尾靜脈回輸治療。生存分析結(jié)果顯示，三組接受不同干細(xì)胞移植的小鼠生存率較肝損傷模型組顯著提高，其中MSCs組的生存率顯著高于HSCs和MSCs+HSCs組。肝組織切片的HE染色顯示，肝損傷模型小鼠的肝組織內(nèi)可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和大量的肝細(xì)胞壞死。天狼星紅染色顯示，肝損傷模型小鼠肝組織內(nèi)可見(jiàn)大量的膠原沉積。與未接受干細(xì)胞治療的對(duì)照小鼠相比，干細(xì)胞治療顯著減輕了小鼠的肝纖維化和炎癥，其中以MSCs的效果最強(qiáng)。研究還表明，MSCs和HSCs在促進(jìn)肝損傷修復(fù)中未顯示協(xié)同效應(yīng)。 4、MSCs和HSCs促進(jìn)肝損傷修復(fù)的機(jī)制 分離接受干細(xì)胞治療的肝損傷小鼠的肝臟。對(duì)肝組織進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)果顯示，HSCs組GFP+/AFP+和GFP+/ALB+雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(分別為4.3±0.6%和3.5±0.7%)較MSCs組(1.4±0.5%和2.1±0.3%)及MSCs+HSCs組(2.8±0.4%和2.4±0.6%)顯著提高。干細(xì)胞治療組α-SMA+細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組均顯著降低，其中MSCs組α-SMA+細(xì)胞數(shù)量最低。未發(fā)現(xiàn)GFP+/α-SMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞，提示移植的干細(xì)胞未轉(zhuǎn)分化為肝星狀細(xì)胞。干細(xì)胞治療組肝組織中Ki-67和PCNA的表達(dá)量顯著升高，以MSCs組最高。 接受干細(xì)胞治療4w后，用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中的生長(zhǎng)因子及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子。結(jié)果顯示，MSCs組神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）水平較其它干細(xì)胞組顯著提高，而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平在各干細(xì)胞移植組之間未見(jiàn)顯著差異。MSCs組IL-10水平較其它干細(xì)胞移植組顯著升高而IL-6、TNF-α水平較其它干細(xì)胞移植組顯著降低。 結(jié)論 1、骨髓來(lái)源的MSCs和HSCs均能向損傷肝臟歸巢，并且MSCs的肝臟歸巢能力更強(qiáng)。 2、對(duì)于CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，MSCs和HSCs都能有效促進(jìn)損傷修復(fù)，其中MSCs的作用更強(qiáng)。 3、干細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生相關(guān)因子和免疫因子的表達(dá)促進(jìn)肝損傷的恢復(fù)。 4、在促進(jìn)CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝損傷修復(fù)過(guò)程中，MSCs和HSCs未表現(xiàn)出協(xié)同效用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575.3

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本文編號(hào)：2270948