【摘要】：研究背景和目的 外傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury, TBI)是指因外部原因引起的腦功能或腦病理學(xué)的改變,是世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題�，F(xiàn)有的針對(duì)TBI的治療尚不能徹底恢復(fù)受損的神經(jīng)功能。研究證實(shí),成體腦內(nèi)尚存在具有產(chǎn)生新生神經(jīng)元功能的細(xì)胞。但是,從患者恢復(fù)的結(jié)果來(lái)看,這種內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)功能的效果是不足的。在過(guò)去的幾十年里,干細(xì)胞替代治療逐漸成為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的熱點(diǎn),并且在世界范圍內(nèi)進(jìn)行了廣泛的研究。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stromal Cell, MSC)由于其具有獲取容易,且?guī)缀醮嬖谟谒薪M織中,例如骨髓、脂肪組織、臍帶、新生兒肝臟、肌肉及肺部等,并且容易體外擴(kuò)增等特點(diǎn),從而成為干細(xì)胞治療的主力軍[3-5]。 目前已經(jīng)有諸多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSC,對(duì)TBI、腦中風(fēng)、神經(jīng)退行性疾病等具有治療作用[6-10]。目前認(rèn)為MSC通過(guò)分泌一系列因子,達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生(Neurogenesis)、血管發(fā)生(Angiogenesis),減輕細(xì)胞凋亡,控制炎癥的目的。 重復(fù)經(jīng)顱磁刺激Repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS),作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新的研究工具,近二十年慢慢用于臨床。因其無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單易行、較好的定位性,無(wú)需進(jìn)行大量臨床前研究即可用于臨床,因此廣泛應(yīng)用于臨床多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療以及研究。大量臨床研究證實(shí)TMS能夠改善腦外傷患者的康復(fù)。TMS治療腦外傷的機(jī)制雖然尚不完全清楚,但目前的觀點(diǎn)認(rèn)為主要通過(guò)對(duì)神經(jīng)興奮性的調(diào)控,表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term Potentiation, LTP)/長(zhǎng)時(shí)程抑制(Long-term Depression, LTD)來(lái)發(fā)揮其治療作用。一般認(rèn)為高頻rTMS能夠誘導(dǎo)LTP,從而改善TBI后神經(jīng)功能的恢復(fù)。 目前尚無(wú)TMS聯(lián)合MSC治療TBI的研究,本研究將首次探索MSC腦內(nèi)移植,聯(lián)合rTMS干預(yù)治療對(duì)TBI后大鼠腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生、損傷灶周邊凋亡機(jī)制進(jìn)行探索。 方法 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,體重210-249g,利用Feeney自由落體法制作大鼠TBI模型。用改良神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評(píng)分(mNSS)評(píng)價(jià)大鼠造模術(shù)后第1、7、14及28天的行為學(xué)表現(xiàn)。根據(jù)POI評(píng)分,將大鼠分層隨機(jī)分為①單純損傷組；②損傷+TMS組；③損傷+hAD-MSC組；④損傷+TMS+hAD-MSC組。于術(shù)后第2天開(kāi)始TMS,具體參數(shù)如下：放電電壓700V,頻率5Hz,第②、③組每只大鼠每日接受900個(gè)脈沖刺激。于術(shù)后第2天行hAD-MSC腦內(nèi)植入術(shù),第③、④大鼠各植入hAD-MSC5*105。分別在術(shù)后第7、14及28天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)將大鼠分批處死,予生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌流后取腦,石蠟包埋切片,行HE和免疫組化染色。免疫組化指標(biāo)：細(xì)胞增殖標(biāo)記物BrdU,神經(jīng)干細(xì)胞及祖細(xì)胞標(biāo)記物musashil,成熟神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN,細(xì)胞凋亡標(biāo)記物caspase-3, hAD-MSC標(biāo)志物抗人核單克隆抗體。部分大鼠在P02、P05和P013行18F-FDG micro-PET檢查。 結(jié)果 1、P02開(kāi)始,TMS干預(yù)組較無(wú)TMS干預(yù)組能夠顯著降低TBI后大鼠死亡率(two-way ANOVA, p=0.025); PO14起TMS有改善TBI后大鼠行為學(xué)評(píng)分的趨勢(shì)(two-way ANOVA, p=0.104),表現(xiàn)為mNSS的降低。P028開(kāi)始,TMS能夠顯著降低TBI后大鼠損傷側(cè)腦實(shí)質(zhì)的減少(two-way ANOVA, p=0.045)。PO13開(kāi)始,TMS有提高TBI后大鼠損傷灶周邊代謝的趨勢(shì)(two-way ANOVA, p=0.075)。尚不能證明TMS具有促進(jìn)TBI后大鼠內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生,以及抑制損傷灶周邊細(xì)胞凋亡的作用。 2、P02開(kāi)始,MSC干預(yù)組較無(wú)MSC干預(yù)組能夠降低TBI后大鼠死亡率,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(two-way ANOVA, p=0.800); PO14起MSC有改善TBI后大鼠行為學(xué)評(píng)分的趨勢(shì)(two-way ANOVA, p=0.179),表現(xiàn)為mNSS的降低。P028開(kāi)始,MSC有降低TBI后大鼠損傷側(cè)腦實(shí)質(zhì)的減少的趨勢(shì)(two-way ANO VA,p=0.181)。PO13開(kāi)始,MSC有提高TBI后大鼠損傷灶周邊代謝的趨勢(shì)(two-way ANOVA, p=0.136)。P028開(kāi)始,MSC有顯著促進(jìn)TBI后大鼠SVZ區(qū)細(xì)胞增殖的作用,表現(xiàn)為BrdU+細(xì)胞計(jì)數(shù)較無(wú)MSC組的升高(two-way ANOVA, p=0.012),但Musashil染色并無(wú)顯著差異。尚不能證明MSC具有促進(jìn)TBI后大鼠內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生、以及抑制損傷灶周邊細(xì)胞凋亡的作用。 3、研究尚不能證明TMS與MSC之間在治療TBI后大鼠上有相互協(xié)同或相互抑制的作用。 4、抗人核單克隆抗體追蹤植入TBI后大鼠腦內(nèi)hAD-MSC結(jié)果顯示,移植后28d仍有絕大多數(shù)大鼠可檢測(cè)到存活hAD-MSC。存活的hAD-MSC幾乎全部分布于梗死灶周邊。 結(jié)論 1.腦內(nèi)移植hAD-MSC具有顯著提高SVZ區(qū)細(xì)胞增殖的作用,以及具有改善損傷灶周圍腦代謝及減少TBI后腦實(shí)質(zhì)的減少的趨勢(shì)。尚不能證明hAD-MSC有降低損傷灶周邊細(xì)胞凋亡的作用。 2.TMS能夠顯著降低TBI大鼠的死亡率及TBI后腦實(shí)質(zhì)的減少,并且有改善損傷灶周圍腦代謝的趨勢(shì),這種作用可能與TMS改善損傷灶周圍血供、降低炎癥反應(yīng)相關(guān)。該研究尚不能證明TMS有促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生、降低損傷灶周邊細(xì)胞凋亡的作用。 3. hAD-MSC*TMS二者之間沒(méi)有顯著的交互作用。 4. hAD-MSC移植到腦內(nèi)后幾乎全部分布于損傷灶周邊,至術(shù)后28天絕大多數(shù)大鼠仍可檢測(cè)到hAD-MSC的存活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R651.15

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本文編號(hào)：2260493