發(fā)布時間：2018-09-14 20:48

【摘要】：目的：目前國際上尚缺乏顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury, TBI)相關(guān)凝血功能障礙明確的發(fā)生機(jī)制及有效的治療方法。本實驗將通過建立中型TBI小鼠模型,觀察循環(huán)血中神經(jīng)細(xì)胞來源microparticles (brain-derived microparticles, BDMP)含量及凝血功能變化,結(jié)合體外制備BDMP的方法,體外研究BDMP的促凝作用,與血小板的相互作用及Lactadherin蛋白對BDMP的清除作用。試圖闡明TBI相關(guān)凝血功能障礙的物質(zhì)基礎(chǔ),明確TBI相關(guān)凝血功能障礙的發(fā)生機(jī)制,探討建立預(yù)防治療TBI引起的凝血功能障礙的新方法,成為研究TBI相關(guān)凝血功能障礙機(jī)制的新方向。 方法：1)建立中型TBI小鼠模型,應(yīng)用流式細(xì)胞儀和活化因子X凝血時間實驗,檢測TBI小鼠循環(huán)血中BDMP含量及凝血功能的變化；2)應(yīng)用腦組織勻漿分步離心的方法體外制備BDMP;3)應(yīng)用透射電鏡、流式細(xì)胞儀和Western Blot方法鑒定所得BDMP的形態(tài)學(xué)及表型；4)應(yīng)用活化因子X凝血時間實驗和凝血酶生成實驗,體外檢測BDMP的促凝作用；5)經(jīng)鼠尾靜脈注射BDMP到正常小鼠體內(nèi),應(yīng)用活化因子X凝血時間實驗、血漿纖維蛋白原水平測定和病理PTAH染色方法,體內(nèi)檢測BDMP的促凝作用；6)應(yīng)用流式細(xì)胞儀和掃描電鏡觀察BDMP與血小板的結(jié)合情況；7)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測BDMP對血小板的活化作用。8)應(yīng)用Transwell小室系統(tǒng)檢測BDMP在血小板介導(dǎo)下穿透HUVEC細(xì)胞的能力；9)應(yīng)用流式細(xì)胞儀和活化因子X凝血時間實驗檢測Lactadherin蛋白對BDMP的清除作用。 結(jié)果：1)TBI小鼠循環(huán)血中BDMP呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,在TBI后3h時其表達(dá)達(dá)到頂峰。小鼠TBI后3h的貧血小板血漿(platelet poor plasma, PPP)其凝血時間明顯縮短,此時PPP中BDMP的表達(dá)最高。而在經(jīng)過超速離心將BDMP去除后,無MP血漿(MP-free plasma, MPFP)的凝血時間明顯延長；2)透射電鏡下BDMP具有完整的膜結(jié)構(gòu),且表面表達(dá)大量的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)。流式細(xì)胞及Western Blot結(jié)果顯示BDMP表達(dá)大量的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記,而不表達(dá)血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。BDMP上磷脂酰絲氨酸(PS)和組織因子在體外具有促凝作用。最后將BDMP注射到正常小鼠體內(nèi),小鼠PPP的凝血時間明顯延長,血漿纖維蛋白原明顯降低,組織中纖維素沉積明顯；3)流式細(xì)胞儀和掃描電鏡觀察至BDMP能夠與血小板結(jié)合,其結(jié)合后可以促進(jìn)血小板表面PS的表達(dá)增加,同時可以激活血小板,導(dǎo)致血小板活化標(biāo)志P-選擇素表達(dá)增加和鈣離子內(nèi)流增加。反過來,激活的血小板可以介導(dǎo)BDMP穿透激活的HUVEC細(xì)胞；4)Lactadherin蛋白可以和BDMP結(jié)合,并在結(jié)合后減弱BDMP的促凝作用。 結(jié)論：1)TBI小鼠循環(huán)血中檢測到具有促凝活性的BDMP,可能是發(fā)生TBI相關(guān)凝血功能障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)；2)通過腦組織勻漿分步離心的方法在體外成功制備出了大量的、純度高的BDMP,為后續(xù)的體外實驗提供了充足的原料；3)BDMP能夠激活血小板,而激活的血小板可以協(xié)助BDMP穿透BBB,部分解釋了TBI相關(guān)凝血功能障礙的發(fā)生機(jī)制；4)BDMP可與Lactadherin蛋白結(jié)合,能夠抑制BDMP的促凝活性,該BDMP的清除機(jī)制,為TBI合并凝血功能障礙的治療提供了一條新思路。
[Abstract]:OBJECTIVE: There is no definite mechanism and effective treatment for traumatic brain injury (TBI) related coagulation dysfunction in the world. In this study, we will establish a medium-sized TBI mouse model to observe the content of brain-derived microparticles (BDMP) in circulating blood and the coagulation function. In order to clarify the material basis of TBI-related coagulation dysfunction, to clarify the mechanism of TBI-related coagulation dysfunction, and to explore the prevention and treatment of TBI-induced coagulation dysfunction. The new method has become a new direction for studying the mechanism of TBI related coagulation dysfunction.
Methods: 1) To establish a medium-sized TBI mice model and detect the changes of BDMP content and coagulation function in circulating blood of TBI mice by flow cytometry and activating factor X coagulation time test; 2) To prepare BDMP by step centrifugation of brain tissue homogenate in vitro; 3) To identify the morphology of BDMP by transmission electron microscopy, flow cytometry and Western Blot method. 4) The coagulation-promoting effect of BDMP was detected in vitro by coagulation time test and thrombin production test with activator X. 5) The coagulation-promoting effect of BDMP was detected in vivo by coagulation time test with activator X, plasma fibrinogen level and pathological PTAH staining after injecting BDMP into the tail vein of mice. Flow cytometry and scanning electron microscopy were used to observe the binding of BDMP to platelets; 7) Flow cytometry was used to detect the activation of BDMP on platelets; 8) Transwell chamber system was used to detect the ability of BDMP to penetrate HUVEC cells mediated by platelets; 9) Flow cytometry and activating factor X coagulation time test were used to detect Lactadheri. The scavenging effect of N protein on BDMP.
Results: 1) BDMP expression in circulating blood of TBI mice increased at first and then decreased, and reached its peak at 3 hours after TBI. The platelet poor plasma (PPP) of mice at 3 hours after TBI significantly shortened the coagulation time, and BDMP expression was the highest in PPP. The results of flow cytometry and Western Blot showed that BDMP expressed a lot of specific markers of neurons and glia cells, but not platelets, red blood cells. Leukocyte and endothelial cell markers. Phosphatidylserine (PS) and tissue factor on BDMP can promote coagulation in vitro. At last, BDMP was injected into normal mice. The coagulation time of PPP in mice was prolonged, plasma fibrinogen was decreased, and cellulose deposition was observed by flow cytometry and scanning electron microscopy. In turn, activated platelets can mediate BDMP penetration through activated HUVEC cells; 4) Lactadherin can bind to BDMP. The procoagulant action of BDMP was weakened after binding.
CONCLUSION: 1) BDMP with procoagulant activity was detected in circulating blood of TBI mice, which may be the material basis of TBI-related coagulation dysfunction; 2) BDMP with high purity was successfully prepared by stepwise centrifugation of brain tissue homogenate in vitro, providing sufficient raw materials for subsequent in vitro experiments; 3) BDMP can activate blood. Platelets, and activated platelets can help BDMP penetrate BBB, which partly explains the mechanism of TBI-related coagulation dysfunction; 4) BDMP can bind to Lactadherin protein and inhibit the coagulation-promoting activity of BDMP. The clearance mechanism of BDMP provides a new idea for the treatment of TBI with coagulation dysfunction.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

【共引文獻(xiàn)】

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3 薛富善;孫海燕;李平;張國華;;細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)刊;2007年04期

4 邵亞輝,許頂立,曾平,賴文巖,任昊,江榮炎;糖基化終極產(chǎn)物對乳鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣瞬間變化的影響[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年03期

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6 李曉興;馬建華;季海明;劉藝春;印佳;封林森;;顱腦外傷后血漿凝血及纖溶指標(biāo)的變化及意義[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年24期

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8 曾和松,劉正湘;Losartan和人參對實驗性大鼠心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡影響的比較研究[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2002年04期

9 劉斌;李永平;;深低溫反復(fù)凍融對人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤OCM-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[J];國際眼科雜志;2006年05期

10 陳鑫;劉運(yùn)生;劉志雄;劉勁芳;楊魁;李春濤;劉忠富;;進(jìn)行性出血性腦損傷病灶體積變化對手術(shù)治療的影響[J];國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志;2011年01期

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2 Chandan K.Sen;Cameron Rink;Savita Khanna;;Palm Oil-Derived Natural Vitamin Eα-Tocotrienol in Brain Health and Disease[A];Journal of the American College of Nutrition（Volume29，，Number3（s），June2010）[C];2010年

3 孫啟銘;張國忠;韓業(yè)興;谷建平;李瑞利;馮國偉;;靜脈血栓形成及引發(fā)肺栓塞的機(jī)制探討[A];中國法醫(yī)學(xué)理論與實踐創(chuàng)新成果精選——全國第九次法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2013年

4 鮑計章;周永明;趙心華;朱文偉;胡明輝;周韶虹;許毅;孫偉玲;王婕;李艷;胡令彥;陳海琳;曾慶;;血小板微顆粒與免疫性血小板減少癥的關(guān)系[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會第二屆岐黃論壇——血液病中醫(yī)藥防治分論壇論文集[C];2014年

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本文編號：2243828