【摘要】：研究背景膿毒癥(sepsis)是由感染誘發(fā)的機體調(diào)節(jié)失衡所致的危及生命的器官功能不全。其高發(fā)病率和高死亡率耗費了大量的醫(yī)療資源。據(jù)統(tǒng)計,美國每年嚴重膿毒癥患者的新發(fā)病例約為750,000,并且以每年1.5%的速度增長,到2020年,每年將增加上百萬的膿毒癥患者。膿毒癥的發(fā)病機制很復雜,其主要的病理生理可以概括為：細胞因子及細胞炎癥介質(zhì)過多釋放、腸道細菌的移位及由此導致的內(nèi)毒素血癥、凝血功能紊亂與炎癥系統(tǒng)的相互作用、以及微循環(huán)衰竭和線粒體功能損害等。近年來,膿毒癥導致的線粒體功能不全成為研究熱點。有研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥時心功能障礙的發(fā)生率高達40%。入住ICU的膿毒癥患者,存在心肌抑制因素的患者與比沒有心肌抑制因素的相比,第一個24小時需要更多的液體進行復蘇,而且死亡率更高。一系列體內(nèi)及體外的研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥心肌損害與膿毒癥的惡化密切相關(guān)。心臟富含線粒體,膿毒癥中線粒體的功能障礙越來越被學者關(guān)注。以前的研究顯示,很多因素與膿毒癥心肌損害的發(fā)生有關(guān),如ROS的過多產(chǎn)生,ATP能量合成的不足,以及線粒體膜電位的破壞等因素。目前,關(guān)于膿毒癥患者發(fā)生心肌功能損害的具體機制仍然不是很清楚。這可能與微循環(huán)改變、心肌細胞線粒體功能障礙、細胞凋亡、炎癥通路損傷、氧化應激等因素相關(guān)。而線粒體作為膿毒癥損傷的一個重要靶點,其在心肌損傷過程中的作用,越來越受到重視。線粒體膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白——解偶聯(lián)蛋白(uncoupling proteins, UCPs)存在于所有的哺乳動物中,屬于線粒體陰離子通道(nion channels)家族,UCPs基因有高度的保守性,有6個家族成員,在人僅表達UCP1-5。UCP3基因位于11q13,與UCP2緊密連鎖,相隔僅6000bp,其氨基酸序列與UCP1和UCP2的同源性高達57%和73%,廣泛表達與各組織細胞。化學滲透假說(chemiosmotic hypothesis)認為,氧化磷酸化偶聯(lián)的基本原理是：電子傳遞中的自由能差造成H+穿膜傳遞,暫時轉(zhuǎn)變成電化學質(zhì)子梯度,這種勢能又驅(qū)使H+回流,并釋放能量,驅(qū)動結(jié)合在內(nèi)膜上的ATP合成酶,催化ADP磷酸化合成ATP。然而,在某些生理或病理條件下,H+不通過ATP合成酶而是通過其他通道也可以從線粒體內(nèi)膜滲漏到線粒體基質(zhì)中,但此過程不產(chǎn)生ATP。后來這種解偶聯(lián)作用被證實是由線粒體內(nèi)膜上的運載體UCPs所介導的。目前有關(guān)UCP的研究主要集中于代謝紊亂時糖、脂及氧化應激代謝調(diào)控。不論在體內(nèi)還是體外,UCP2的上調(diào)可以通過調(diào)控膜電位、線粒體ROS及ATP合成進而保護神經(jīng)元細胞,而UCP2敲除則會導致線粒體ROS產(chǎn)生明顯增多。此外,UCP2還參與調(diào)控各種生理及病理過程,如食物的攝入量、代謝性疾病及動脈粥樣斑塊的形成等。當線粒體內(nèi)膜電勢升高時,UCP2可降低△μH+,從而抑制ROS的產(chǎn)生。Derdak等研究發(fā)現(xiàn)解耦聯(lián)蛋白2(UCP-2)可抑制NF-kB的產(chǎn)生,進而降低ROS生成,從而抑制氧化應激對心肌細胞的損傷。然而,UCP2在膿毒癥心肌細胞中的作用仍然不明確。UCP2是否可以通過調(diào)控線粒體膜電位抑制ROS的合成進而保護心肌細胞尚需要更進一步的研究。我們假設在膿毒癥下UCP2通過調(diào)控膜電位進而保護心肌細胞。本研究在構(gòu)建UCP2過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)株心肌細胞和RNAi抑制UCP2的基礎上,用Lps/PepG刺激,檢測線粒體形態(tài)與功能的相關(guān)指標,揭示UCP2在膿毒癥心肌細胞中的保護作用機制。研究目的及意義本課題在構(gòu)建UCP2過表達及RNAi沉默UCP2的穩(wěn)轉(zhuǎn)株心肌細胞基礎上,用脂多糖及肽聚糖混合制劑刺激細胞,通過檢測心肌細胞線粒體的形態(tài),線粒體腫脹度、線粒體膜電位、線粒體ROS及氧化應激指標、線粒體ATP含量、線粒體mtDNA等指標,揭示UCP2在膿毒癥心肌細胞線粒體中的保護作用及機制,為臨床治療膿毒癥時心肌損傷提供基礎理論支持。研究方法1、實驗分組①RNA干擾篩選實驗分組：篩選有效的UCP2干擾基因片段。將H9C2心肌細胞隨機分成五組,分別為：①Control組,給予等量的生理鹽水；②Lipofectam ine組,給予等量的Lipofectamine 2000;③siRNAl組,給予siRNAl干擾序列；④siRNA2組,給予siRNA2干擾序列；⑤ncRNA組,給予ncRNA序列。上述各siRNA的終濃度為80nmol/1。②干擾實驗分組：將H9C2心肌細胞隨機分成四組,分別為：①Control組,給予生理鹽水刺激；②LPS/PepG組,給予LPS及PepG刺激；③LPS/PepG+siRNA組,給予LPS及PepG刺激后予siRNA干預；④LPS/PepG+ncRNA組,給予LPS及PepG刺激后予ncRNA干預。上述LPS的終濃度為2 μg/ml, PepG的終濃度為20μg/ml。③過表達細胞分組：將H9C2心肌細胞隨機分成四組,分別為：①Control組,給予生理鹽水刺激；②LPS/PepG組,給予LPS及PepG刺激；③PHBLV組,空病毒載體轉(zhuǎn)染H9C2細胞,然后給予LPS及PepG刺激；④PHBLV-UCP2組,然后給予LPS及PepG刺激UCP2過表達H9C2細胞。上述LPS的終濃度為2μg/ml, PepG的終濃度為20 μg/ml。2、RNA干擾實驗①結(jié)合文獻及前期實驗結(jié)果,按照RNA干擾片段設計方法,設計2條RNA干擾片段,先進行預實驗,確定有效的siRNA;然后以此siRNA作為干擾片段,進行RNA干擾實驗；②將siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞,然后觀察其在膿毒癥條件下,對線粒體形態(tài)及功能的影響。3、UCP2過表達慢病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定心肌細胞株的篩選①提取大鼠總的RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,調(diào)取UCP2目的基因并進行PCR擴增,電泳回收目的基因。pMD19-T載體(克隆載體)與UCP2目的基因的連接,然后轉(zhuǎn)染新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆并測序。②從UCP2重構(gòu)的T質(zhì)粒中擴增目的基因, 然后與慢病毒穿梭載體pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro進行連接；然后將連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化及擴增、并測序。③慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染293T細胞,收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,過濾并超離心濃縮病毒,并進行濃度滴定。④慢病毒感染穩(wěn)定細胞系,慢病毒感染心肌細胞后,用嘌呤霉素進行篩選,直至篩選完全。因載體能合成抗篩選藥物的蛋白而得以存活,以空載的細胞為陰性對照實驗。經(jīng)PCR及WB驗證,證實UCP2過表達H9C2細胞株建立成功,可進行下一步實驗。4、膿毒癥心肌細胞模型指標：CK及LDH, IL-6及TNF-a水平①比色法檢測肌酸激酶：用多功能酶標儀,按照南京建成的檢測肌酸激酶測試盒說明書,進行操作。②比色法檢測乳酸脫氫酶：用多功能酶標儀,按照南京建成的檢測乳酸脫氫酶(LDH)測試盒說明書進行操作。③ ELISA法檢測IL-6水平：根據(jù)試劑盒說明進行操作。試劑盒為：Rat Interleukin 6 (IL-6) ELISA Kit? Cusabio Life Science, Wuhan, China.④ ELISA法檢測TNF-a水平：根據(jù)試劑盒說明進行操作。試劑盒為：Rat TNF-a ELISA Kit, Cusabio Life Science, Wuhan, China。5、線粒體形態(tài)分析：電鏡觀察線粒體形態(tài)學變化,流式細胞儀檢測線粒體腫脹度①電鏡觀察標本制備：培養(yǎng)并收集心肌細胞,先用3%戊二醇固定,再予1%餓酸后固定,用酒精脫水,然后置換、包埋、浸透、包埋。電鏡修塊,在AO超薄切片機下切1μM的半薄切片,飽和醋酸雙氧鈾染后電鏡下觀察。②線粒體腫脹度檢測：采用流式細胞儀(flow cytometry, FCM)常規(guī)的綠色熒光(FITC-H)和紅色熒光(PI-H)進行檢測,以紅色熒光強度／綠色熒光強度計算膜電位,比值可間接反映線粒體膜電位變化。以前向角散射(forward scatter, FSC)和側(cè)向角散(sidescatter, SSC)平均熒光強度的比值(FSC/SSC)反應線粒體腫脹度。6、激光共聚焦顯微鏡定性觀察線粒體膜電位與流式細胞儀定量分析膜電位①激光共聚焦顯微鏡定性觀察線粒體膜電位：采用JC-1染色,原理與流式細胞儀檢測一致。在6孔培養(yǎng)板上H9C2心肌細胞用JC-1進行熒光染色,然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察,紅色熒光與綠色熒光的比例代表了線粒體膜電位。②流式細胞儀定量分析線粒體膜電位：采用一種陽離子脂質(zhì)熒光染JC-1作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài),在低濃度時以單體的形式存在,高濃度時以多聚體形式存在,兩者的發(fā)射光譜不同。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位升高時,JC-1聚合體形式增加,FL-2/FL-1比值升高；線粒體膜電位下降時,JC-1單體形式增加,FL-2/FL-1比值降低。7、Real-time RT-PCR及Western Blot檢測UCP2在基因水平及蛋白水平的表達①WB使用線粒體提取試劑盒提取大鼠心肌組織線粒體蛋白,用BCA法測蛋白濃度。以β-actin蛋白作為內(nèi)參。通過ECL顯影。Gel-Pro analyzer 4.0軟件比較各條帶的灰度值,分析各蛋白在表達水平變化。②T-PCR檢測使用Takara公司試劑盒及PCR儀進行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應。ABI7500熒光定量PCR儀上樣,按照擴增標準程序進行。每個樣本設置3個復孔,計時取平均值,18sRNA作為內(nèi)參基因,使用2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。8、線粒體氧化應激損傷相關(guān)檢測：MDA、SOD、GSH等的檢測。氧化應激因子檢測按照SOD、MDA、GSH檢測試劑盒說明書進行。通過考馬斯亮藍法檢測線粒體蛋白濃度,按照說明書要求將線粒體蛋白加入反應液后反應,酶標儀上設置不同的檢測波長讀出OD值,根據(jù)公式計算出酶活性或濃度。9、線粒體功能檢測：線粒體ATP含量檢測,線粒體ROS檢測,線粒體mtDNA檢測。①線粒體ROS檢測：熒光探針DCFH-DA沒有熒光,可以自由穿過細胞膜,進入細胞內(nèi)后,可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜,從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。②線粒體ATP含量檢測：按照說明進行分光光度計檢測。通常細胞在凋亡、壞死或處于一些毒性狀態(tài)下,ATP水平會下降,而高葡萄糖刺激等對于一些細胞可以上調(diào)細胞內(nèi)ATP水平。具體操作過程按照試劑盒說明書進行。③線粒體mtDNA檢測：設計cytb引物,然后提取線粒體總的DNA,然后以該總的DNA為模板,進行熒光定量PCR,檢測cytb的拷貝數(shù)反映線粒體mtDNA的水平。10、統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 18統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計描述及統(tǒng)計推斷。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示。計量資料符合正態(tài)分布且方差齊時,則采用多樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA);若各組間差異有統(tǒng)計學意義,方差齊者進一步使用LSD檢驗進行多樣本均數(shù)兩兩比較,方差不齊者使用Welch校正后再使用Games-Howell法比較。P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1、膿毒癥細胞模型成功建立：我們用來自金黃色葡萄球菌細胞壁上的PepG與來自革蘭陰性菌LPS組成混合劑,刺激H9C2心肌細胞后,檢測到Lps/PepG組細胞培養(yǎng)液中的CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平明顯高于Control組。Control組線粒體邊界清楚,基質(zhì)均勻,線粒體嵴致密,形態(tài)大致正常。Lps/PepG組線粒體邊界模糊不清,體積明顯腫脹,基質(zhì)密度降低,部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解,甚至嵴斷裂現(xiàn)象,可見空泡樣變。這提示膿毒癥的細胞模型構(gòu)建成功。2、RNA干擾片段篩選結(jié)果：與Control組相比,SiRNA1組和SiRNA2組UCP2-mRNA基因拷貝數(shù)明顯降低,分別下降了59%和69%,差異有統(tǒng)計學意義,故選擇SiRNA2干擾片段作為后續(xù)UCP2基因干擾實驗。3、UCP2基因的表達結(jié)果：①干擾實驗顯示：Lps/PepG+siRNA組的UCP2蛋白相對密度值和UCP2 mRNA表達相對拷貝數(shù)均明顯低于Control組及Lps/PepG組；②過表達實驗顯示：PHBLV-UCP2組的UCP2蛋白相對密度值及UCP2-mRNA相對拷貝數(shù)均明顯高于Control組及Lps/PepG組。這說明干擾實驗及過表達實驗基因構(gòu)建是成功的。4、UCP2沉默及過表達對CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平影響：①干擾實驗顯示：Lps/PepG+siRNA組的CK水平及LDH水平明顯高于Lps/PepG組;Lps/PepG+siRNA組的TNF-a水平及IL-6水平均明顯高于Lps/PepG組,這提示干擾UCP2導致膿毒癥細胞損傷及炎癥因子釋放進一步加重。②過表達實驗顯示:PHBLV-UCP2組的的CK水平和LDH水平均明顯低于Control組及Lps/PepG組;PHBLV-UCP2組的IL-6水平和TNF-a水平均明顯低于Lps/PepG組,這提示UCP2過表達抑制膿毒癥細胞損傷及炎癥因子的進一步釋放。5、線粒體腫脹度：①干擾實驗顯示：與Lps/PepG組相比,Lps/PepG+siRNA組FSC/SSC值明顯升高,且線粒體形態(tài)損壞更加明顯,表現(xiàn)為線粒體腫脹明顯,基質(zhì)密度降低顯著,可見內(nèi)膜破裂及嵴斷裂,空泡樣變更加明顯；這提示干擾UCP2導致膿毒癥線粒體損傷加重。②過表達實驗顯示：與Lps/PepG組相比,PHBLV-UCP2組的FSC/SSC值明顯將低,線粒體形態(tài)損壞有所改善,表現(xiàn)為線粒體腫脹減輕,基質(zhì)密度增高,內(nèi)膜破裂及嵴斷裂減少,空泡樣變不明顯；這提示UCP2過表達有利于保護膿毒癥線粒體。6、線粒體膜電位：①干擾實驗顯示：與Lps/PepG組相比,Lps/PepG+siRNA組的紅色熒光／綠色熒光比值明顯增高, MMP明顯增高；②過表達實驗顯示：與Lps/PepG組相比,PHBLV-UCP2組的紅色熒光／綠色熒光比值明顯上升,MMP明顯增高；但PHBLV-UCP2組MMP的幅度沒有Lps/PepG+siRNA組高。這提示：UCP2可以調(diào)控膜電位水平,但具體調(diào)控程度尚不明確。7、線粒體ROS及其他氧化應激指標：①干擾實驗：與Lps/PepG組相比,Lps/PepG+siRNA組的ROS及MDA含量明顯高于Lps/PepG組,SOD及GSH明顯降低；提示干擾UCP2導致膿毒癥線粒體氧化應激損害加重。②過表達實驗：與Lps/PepG組相比,PHBLV-UCP2組的ROS及MDA含量明顯降低,SOD及GSH明顯升高；這提示UCP2過表達可以抑制膿毒癥線粒體氧化應激損害。8、線粒體ATP含量及mtDNA拷貝數(shù)：①干擾實驗：與Lps/PepG組相比,Lps/PepG+siRNA組的mtDNA拷貝數(shù)明顯降低,而ATP含量無明顯差別；提示干擾UCP2導致膿毒癥線粒體生物修復功能進一步受到損害。②過表達實驗顯示：與Lps/PepG組相比,PHBLV-UCP2組的mtDNA拷貝數(shù)及ATP含量均明顯增高;這提示UCP2過表達可以保護膿毒癥線粒體能量合成及生物修復功能。結(jié)論：UCP2在膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體損傷中起著保護作用,其機制可能是：UCP2通過解耦聯(lián)作用調(diào)控線粒體膜電位,進而改變線粒體ROS合成的量及速度,維持線粒體ATP的合成及線粒體的生物修復功能,最終起到保護線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7

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本文編號：2219364