發(fā)布時間：2018-09-01 17:07

【摘要】：右美托嘧啶(dexmedetomidine,Dex),一種高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑,因其具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑制交感系統(tǒng)活性且不伴呼吸抑制等優(yōu)勢,從而在ICU患者應(yīng)用中廣受青睞。前期有研究證實:右美托嘧啶可明顯提高膿毒癥患者及大鼠的生存率,同時可通過抗炎,抑制氧化應(yīng)激等機(jī)制發(fā)揮器官保護(hù)作用,但關(guān)于其在膿毒癥時是否可發(fā)揮肝臟保護(hù)作用與相關(guān)具體機(jī)制,尚無結(jié)論性證據(jù)研究。且有大量的基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn),肝臟的功能狀態(tài)可直接影響膿毒癥患者的生存率及預(yù)后,而膿毒癥時以壞死為主要類型的肝細(xì)胞的大量死亡是導(dǎo)致肝臟功能損傷的主要因素之一。另外,一種新的可調(diào)控的細(xì)胞死亡類型--necroptosis被證實參與到了眾多炎性疾病過程中來,另有實驗證實特異性的敲除RIP3-necrptosis的重要通路蛋白-可在膿毒癥時減少肝臟中炎癥細(xì)胞的浸潤,從而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。因此,本研究旨在探討右美托嘧啶是否可在膿毒癥大鼠中發(fā)揮肝臟保護(hù)作用,以及這種保護(hù)作用與抑制necroptosis的發(fā)生是否相關(guān)。第一部分:不同劑量右美托嘧啶對膿毒癥大鼠肝臟功能的不同作用目的:通過觀察不同劑量右美托嘧啶對膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞死亡的不同影響,初步探討其最佳劑量和作用機(jī)制。方法:SPF級健康雄性SD大鼠80只,體重200~220g,6~8周齡,于尾靜脈置管后按照隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為5組(n=16):假手術(shù)組(Sh組),膿毒癥組(S組),高劑量Dex組(H組),中劑量Dex組(M組)和低劑量Dex組(L組)。其中每組抽取10只觀察24h生存率。S、H、M及L組采用CLP方法制備大鼠膿毒癥模型。Sh組僅暴露盲腸,而不進(jìn)行結(jié)扎或穿孔。H,M和D組分別于術(shù)前經(jīng)尾靜脈置管以5.0μg/kg/h、2.5μg/kg/h、1.0μg/kg/h的劑量持續(xù)輸入Dex1h,Sh和S組持續(xù)輸入等體積生理鹽水。分別于術(shù)后6,12和24h經(jīng)股動脈和尾靜脈取動脈血和靜脈血,檢測動脈血?dú)?ABG),血清AST,ALT水平。于術(shù)后24h處死大鼠取肝臟,進(jìn)行HE及TUNEL染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)及細(xì)胞死亡情況,同時檢測肝臟中IL-6和TNF-α含量。結(jié)果:與Sh組相比,凡是接受了CLP手術(shù)的大鼠,肝酶水平、乳酸含量以及IL-6和TNF-α均增加(P均0.05),PaO_2明顯降低(P均0.05),肝臟形態(tài)學(xué)也有不同的病理改變,細(xì)胞死亡數(shù)目也有所增加。而與S組相比,5μg/kg/h Dex預(yù)處理可明顯降低肝酶以及乳酸水平,減少肝臟中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生,并且可以改善肝臟病理學(xué)改變及減少肝臟細(xì)胞的死亡。結(jié)論:不同劑量右美托嘧啶對膿毒癥大鼠肝臟將產(chǎn)生不同作用,2.5μg/kg/h和5μg/kg/h Dex均可通過抗炎和抑制細(xì)胞死亡作用而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用,而5μg/kg/h效果更好。第二部分:膿毒癥時肝細(xì)胞的死亡類型目的:通過檢測使用necroptosis特異性抑制劑necrostatin-1(Nec-1)后,肝臟組織中necroptosis相關(guān)通路蛋白表達(dá)情況的改變,從而探討necroptosis是否參與到了膿毒癥時肝臟細(xì)胞的死亡中來。方法:SPF級別健康雄性SD大鼠24只(220~220g,6~8周),大鼠尾靜脈置管置入后采用隨機(jī)數(shù)字表法被分入4組(n=6):假手術(shù)組(Sh組)、膿毒癥組(S組),溶劑DMSO組(D組)和Nec-1組(N組)。S、D和N組大鼠采用CLP方法制備大鼠膿毒癥模型。Sh組大鼠處理同第一部分操作。N組和D組分別與術(shù)前1h經(jīng)尾靜脈注入1.0mg/kg Nec-1和等容量的DMSO;Sh組和S組分別于術(shù)前以同樣方式注入等容量生理鹽水。所有大鼠于術(shù)后6h處死并分離肝臟,采用western blot法測定肝臟組織中RIP1、RIP3及MLKL的表達(dá),同時應(yīng)用化學(xué)熒光法檢測組織中ROS的含量。結(jié)果:與Sh組相比,S組,N組和D組肝組織ROS水平升高,RIP1、RIP3及MLKL表達(dá)上調(diào)(P0.05);與S組相比,N組肝中ROS濃度降低,RIP1、RIP3和MLKL表達(dá)下調(diào)(P0.05);Sh組與D組各種指標(biāo)表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:necroptosis參與到了膿毒癥大鼠肝細(xì)胞的死亡中來。第三部分:右美托嘧啶可抑制necroptosis從而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用目的:通過觀察使用Dex預(yù)處理是否能夠引起necroptosis相關(guān)通路蛋白的表達(dá),進(jìn)而探究Dex在膿毒癥時的肝臟保護(hù)作用的發(fā)生與抑制程序性壞死是否相關(guān)。方法:本部分實驗由三個部分組成:(1)32只SPF級別成年大鼠成功置管后,隨機(jī)分為3組(n=8):假手術(shù)組(Sh組),膿毒癥組(S組)和5μg/kg/h Dex組(D組)。(2)40只大鼠隨機(jī)分為5組(n=8):假手術(shù)組(Sh組),膿毒癥組(S組),1.0mg/kg Nec-1組(N1組),0.5mg/kg Nec-1組(N2組)和0.25mg/kg Nec-1組(N3組)。(3)24只大鼠分為3(n=8):假手術(shù)組(Sh組),膿毒癥組(S組),Dex聯(lián)合Nec-1組(ND組)。結(jié)果:(1)與Sh組相比,S組和D組的RIP1、RIP3、MLKL和HMGB1表達(dá)及ROS水平均上調(diào)(P均0.05);與S組相比,接受了Dex預(yù)處理的大鼠三種蛋白表達(dá)及ROS水平均下調(diào)(P均0.05);(2)與Sh組相比,其余四組大鼠四種蛋白表達(dá)均上調(diào)(P均0.05);與S組相比,N1和N2組四種蛋白表達(dá)均下降(P均0.05),而N3組無明顯差異(P0.05)(3)與Sh相比,S組和ND組四中蛋白表達(dá)均升高(P0.05),而與S組相比,ND組四種蛋白表達(dá)下調(diào)(P均0.05)。結(jié)論:右美托嘧啶可通過抑制膿毒癥時肝臟細(xì)胞necroptosis的發(fā)生,進(jìn)而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。
[Abstract]:Dexmedetomidine (Dex), a highly selective alpha 2 adrenergic receptor agonist, is widely used in ICU patients because of its sedative, analgesic, sympathetic suppression and no respiratory depression. Previous studies have confirmed that dexmedetomidine can significantly improve the survival of sepsis patients and rats. However, there is no conclusive evidence to prove whether it can play a protective role in sepsis or not. And a large number of basic and clinical studies have found that the functional status of the liver can directly affect the survival rate and survival rate of patients with sepsis. In addition, a new regulated type of cell death, necroptosis, has been shown to be involved in many inflammatory diseases, and specific knockout of RIP3-necrptosis has been demonstrated to be an important link. The aim of this study was to investigate whether dexmedetopyrimidine could play a hepatoprotective role in septic rats and whether this protective effect was related to the inhibition of necroptosis. OBJECTIVE: To observe the effects of different doses of dexmedetopyrimidine on hepatic cell death in septic rats, and to explore the optimal dosage and mechanism of action. Methods: 80 healthy male SD rats of SPF grade, weighing 200-220 g, aged 6-8 weeks, were treated with caudal vein catheterization according to random number table method. They were randomly divided into five groups (n=16): sham operation group (Sh group), sepsis group (S group), high dose Dex group (H group), middle dose Dex group (M group) and low dose Dex group (L group). Ten rats in each group were selected to observe the 24-hour survival rate. Dex1h, Sh and S groups were continuously infused with normal saline of the same volume at the doses of 5.0ug/kg/h, 2.5ug/kg/h, 1.0ug/kg/h. Arterial blood gas (ABG), serum AST and ALT levels were measured at 6, 12 and 24 hours after operation, respectively. Results: Compared with Sh group, the levels of liver enzymes, lactate, IL-6 and TNF-alpha increased (P 0.05), and the levels of PaO_2 decreased (P 0.05). The morphological changes of liver were also different. Cell death was observed. Compared with S group, pretreatment with 5 ug/kg/h Dex significantly decreased the levels of liver enzymes and lactic acid, decreased the production of IL-6 and TNF-a, and improved the pathological changes of liver and reduced the death of liver cells. Both h and 5ug/kg/h Dex can protect the liver from inflammation and inhibit cell death, but 5ug/kg/h is more effective. Part 2: Types of liver cell death in sepsis Objective: To detect the expression of necroptosis-related pathway protein in liver tissue after the use of necroptosis-specific inhibitor Necrostatin-1 (Nec-1). Methods: Twenty-four healthy male SD rats of SPF grade (220-220 g, 6-8 weeks) were divided into four groups (n=6) by random number table method: sham operation group (Sh group), sepsis group (S group), solvent DMSO group (D group) and Nec-1 group (N group). Rats in groups S, D and N were treated with the same procedure as those in the first part. Group N and D were injected with 1.0mg/kg Nec-1 and D MSO via caudal vein one hour before operation, and group Sh and group S were injected with normal saline in the same way before operation. All rats were sacrificed and their livers were separated 6 hours after operation. Western blot was used to detect the expression of RIP1, RIP3 and MLKL in liver tissues, and chemical fluorescence was used to detect the content of ROS in liver tissues. Conclusion: Neroptosis is involved in the death of hepatocytes in septic rats. Part III: Dextropyrimidine can inhibit the expression of necroptosis-related pathway proteins by observing whether the use of Dex preconditioning can induce the expression of necroptosis-related pathway proteins. Methods: The experiment consisted of three parts: (1) 32 adult rats of SPF grade were randomly divided into three groups (n = 8): sham operation group (S h group), sepsis group (S group) and 5 UG / kg / h Dex group (D group). (2) Forty rats were randomly divided into five groups (n = 8). 8: Sham operation group (Sh group), sepsis group (S group), 1.0mg/kg Nec-1 group (N1 group), 0.5mg/kg Nec-1 group (N2 group) and 0.25mg/kg Nec-1 group (N3 group). (3) Twenty-four rats were divided into 3 (n=8): sham operation group (Sh group), sepsis group (S group), Dex combined with Nec-1 group (ND group). Results: (1) Compared with Sh group, RIML, RIP3, KL and ROHB1 levels in S and D groups were up-regulated. Compared with S group, the expression of three proteins and the level of ROS in Dex pretreated rats were all down-regulated (P 0.05); (2) Compared with Sh group, the expression of four proteins in other four groups were up-regulated (P 0.05); compared with S group, the expression of four proteins in N1 and N2 groups were down-regulated (P 0.05), but there was no significant difference in N3 group (P 0.05) (3) compared with Sh group and ND group. Compared with S group, the expression of four proteins in ND group was down-regulated (P 0.05). CONCLUSION: dexmedetopyrimidine can protect the liver by inhibiting the occurrence of necroptosis in liver cells in sepsis.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7

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本文編號：2217831