【摘要】：膿毒血癥是一種潛在的致命性的全身炎癥反應(yīng)，也稱為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS），是一種由嚴(yán)重的感染引起的具有高發(fā)病率和死亡率的難治性疾病。膿毒血癥同時(shí)也可以被認(rèn)為是從感染到多器官功能損害綜合癥的一種過(guò)度。嚴(yán)重的膿毒血癥可以引起衰竭型器官功能異常，臨床觀察發(fā)現(xiàn)膿毒血癥患者發(fā)展成急性肺損傷（ALI）和急性腎損傷（AKI）的風(fēng)險(xiǎn)很高。目前膿毒血癥中器官之間的損傷干擾及其機(jī)制的研究越來(lái)越受到重視，尤其是涉及到ALI和AKI之間關(guān)系的研究。ALI以及其嚴(yán)重模式-急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）常常導(dǎo)致多器官功能衰竭，臨床上的死亡率大約為30%-50%。此外，作為一個(gè)天然的血液過(guò)濾系統(tǒng)，腎臟成為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)器官損傷的直接靶點(diǎn)。炎癥引起的ALI及AKI在老年人中十分常見，通常死亡率較高，而目前研究發(fā)現(xiàn)Sirt1在老年人中表達(dá)下降。同時(shí)也有報(bào)道表明Sirt1在慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中的表達(dá)下降，所以我們推測(cè)Sirt1在炎癥調(diào)節(jié)中起到一定的作用。我們分別用盲腸結(jié)扎穿刺手術(shù)（CLP）和脂多糖（LPS）引起的膿毒血癥來(lái)研究Sirt1的對(duì)于肺臟和腎臟損傷的作用及其機(jī)制。 Sirtuin1（Sirt1）是Sirtuin家族的成員，是最初發(fā)現(xiàn)于酵母菌的一種脫乙酰酶。不同于經(jīng)典的組蛋白脫乙酰途徑，Sirt1發(fā)揮它的脫乙酰功能是通過(guò)對(duì)賴氨酸殘基的脫乙酰作用來(lái)調(diào)節(jié)其它蛋白質(zhì)的功能，例如核轉(zhuǎn)錄因子kB和p53等。也有越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Sirt1在炎癥、凋亡、抗應(yīng)激、代謝、分化和老化中起到重要作用，而Sirt1在膿毒血癥中作用的相關(guān)研究較少，機(jī)制尚不明確。在本研究中，我們利用Sirt1敲除鼠來(lái)研究其在膿毒血癥引起的急性肺腎損傷中的作用，并進(jìn)一步明確其調(diào)節(jié)作用機(jī)制。我們的實(shí)驗(yàn)證明Sirt1敲除鼠對(duì)膿毒血癥模型引起的ALI和AKI更具有易感性。 在實(shí)驗(yàn)的第一部分中，我們主要研究Sirt1對(duì)于膿毒血癥繼發(fā)的ALI的作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中對(duì)Sirt1基因敲除及其同源性野生型小鼠進(jìn)行CLP手術(shù)，成功造成小鼠膿毒血癥模型。為了明確Sirt1對(duì)于肺損傷的作用及其機(jī)制，本部分實(shí)驗(yàn)從肺中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、促炎癥的釋放和Sirt1調(diào)節(jié)機(jī)制三方面進(jìn)行研究。為了了解中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，我們檢測(cè)了CLP術(shù)后24小時(shí)肺組織勻漿中髓過(guò)氧化物酶（MPO）的活性。隨后我們應(yīng)用試劑盒檢測(cè)造模后6小時(shí)和24小時(shí)后的血清中及肺組織中IL-6和TNF-α水平，結(jié)果顯示Sirt1基因敲除明顯增加MPO的活性，并且提高了促炎癥因子的水平。為了進(jìn)一步了解Sirt1調(diào)節(jié)肺內(nèi)炎癥的機(jī)制，我們應(yīng)用western blot檢測(cè)Sirt1調(diào)節(jié)的直接和間接靶點(diǎn)蛋白在肺內(nèi)的表達(dá)。外源性和內(nèi)源性感染因子進(jìn)入到體內(nèi)后，促進(jìn)了NF-kB的活化，隨后調(diào)節(jié)各種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致不可逆的過(guò)度的炎癥反應(yīng)發(fā)生。我們的研究證明了Sirt1基因敲除鼠的肺內(nèi)NF-kB的活化增強(qiáng)，同時(shí)其下游黏附分子-細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（stat3）以及caspase3，caspase7的表達(dá)明顯增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Sirt1敲除通過(guò)觸發(fā)過(guò)度的炎癥以及相關(guān)炎癥復(fù)合物途徑而使肺損傷增強(qiáng)。 在第二部分實(shí)驗(yàn)中，我們主要研究Sirt1在調(diào)節(jié)膿毒血癥繼發(fā)的腎損傷中的作用及其機(jī)制。我們應(yīng)用LPS誘導(dǎo)小鼠建立膿毒血癥模型。首先通過(guò)血清尿素氮（BUN）和尿液腎臟損傷分子（KIM-1）的檢測(cè)顯示在膿毒血癥中腎臟功能明顯受損。進(jìn)一步的組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)膿毒血癥也引起腎小管的損傷和炎癥。腎臟的炎癥與促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生增加與黏附分子的上調(diào)（例如ICAM-1和VCAM-1）有密切關(guān)系。這些早期的炎癥反應(yīng)在腎損傷的過(guò)程中引起炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，而過(guò)度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)則可引起進(jìn)一步的腎損傷。在炎癥因子的調(diào)節(jié)過(guò)程中NF-kB調(diào)節(jié)各種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)進(jìn)程，本部分研究發(fā)現(xiàn)Sirt1基因敲除導(dǎo)致NF-kB的活化，隨后活化的NF-kB引起包括IL-6和TNF-α在內(nèi)的細(xì)胞因子的增加，這些炎癥因子的增加是AKI的明顯標(biāo)志。同時(shí)細(xì)胞因子也可以引起信號(hào)通路的活化，，例如Stat3和ERK1/2調(diào)節(jié)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)等途徑。以上實(shí)驗(yàn)證明Sirt1在膿毒血癥引起的AKI中具有保護(hù)作用，并通過(guò)調(diào)節(jié)NF-kB的活化產(chǎn)生其保護(hù)機(jī)制。 綜上所述，Sirt1在膿毒血癥引起的急性肺腎損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。Sirt1發(fā)揮它的保護(hù)功能主要是通過(guò)對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子的活化的調(diào)控，繼而引發(fā)Stat3，ERK1/2、caspase等炎癥通路的活化。因此我們的研究表明Sirt1是一個(gè)潛在的膿毒血癥引起的肺腎損傷的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:Sepsis is a potentially fatal systemic inflammatory response, also known as systemic inflammatory response syndrome (SIRS), a refractory disease with high morbidity and mortality from severe infections. Sepsis can also be considered an excess from infection to multiple organ dysfunction syndrome. Sepsis can cause organ dysfunction of failure type. Clinical observation shows that patients with sepsis have a high risk of developing acute lung injury (ALI) and acute kidney injury (AKI). Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), a severe form of ARDS, often leads to multiple organ failure (MOF) with a clinical mortality rate of about 30% - 50%. In addition, as a natural blood filtration system, the kidney becomes a direct target for organ damage in systemic inflammatory reactors. The expression of Sirt1 was decreased in the elderly. It was also reported that the expression of Sirt1 was decreased in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), so we speculated that Sirt1 might play a role in the regulation of inflammation. We used cecum ligation puncture (CLP) and lipopolysaccharide (LPS) to induce sepsis, respectively. To study the effect and mechanism of Sirt1 on lung and kidney injury.
Sirtuin 1 (Sirt1), a member of the Sirtuin family, is a deacetylase first discovered in yeast. Unlike the classical histone deacetylation pathway, Sirt1 exerts its deacetylation function by deacetylating lysine residues to regulate other protein functions, such as nuclear transcription factors kB and p53. Sirt1 has been found to play an important role in inflammation, apoptosis, anti-stress, metabolism, differentiation and aging, while the role of Sirt1 in sepsis has not been well understood. In this study, we used Sirt1 knockout mice to study its role in acute lung and kidney injury induced by sepsis and to further clarify its regulation. Our experiments showed that Sirt1 knockout mice were more susceptible to ALI and AKI induced by sepsis.
In the first part of the experiment, we mainly studied the effect and mechanism of Sirt1 on ALI secondary to sepsis. In the experiment, we performed CLP on the wild type mice with Sirt1 gene knockout and its homology, and successfully induced sepsis model in mice. To understand the infiltration of neutrophils, we examined the activity of myeloperoxidase (MPO) in lung tissue homogenate 24 hours after CLP. Then we used kits to detect IL-6 in serum and lung tissue 6 hours and 24 hours after CLP. In order to further understand the mechanism of Sirt1 regulating pulmonary inflammation, we used Western blot to detect the expression of Sirt1-regulated direct and indirect target proteins in the lung. Our study demonstrated that the activation of NF-kB in the lungs of Sirt1 knockout mice was enhanced, and the downstream adhesion molecule-intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) were fine. The expression of extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2), signal transduction activator 3 (stat3), caspase 3, and caspase 7 were significantly increased. The above results demonstrated that Sirt1 knockout enhanced lung injury by triggering excessive inflammation and related inflammatory complex pathways.
In the second part of the experiment, we mainly studied the role and mechanism of Sirt1 in regulating renal injury secondary to sepsis. We established sepsis model in LPS-induced mice. First, the detection of BUN and KIM-1 in serum showed that renal function was significantly impaired in sepsis. Histological examination revealed that sepsis also caused renal tubular injury and inflammation. Increased inflammation and the production of pro-inflammatory mediators were closely related to the up-regulation of adhesion molecules (such as ICAM-1 and VCAM-1). These early inflammatory reactions caused infiltration of inflammatory cells during renal injury, whereas excessive infiltration of inflammatory cells could be induced. NF-kB regulates the transcription of various inflammatory factors during the regulation of inflammatory factors, thereby affecting the process of inflammation. Sirt1 knockout leads to the activation of NF-kB, and subsequently activated NF-kB leads to the increase of cytokines including IL-6 and TNF-alpha, which is the result of AKI. Significant markers. Cytokines can also activate signaling pathways, such as the cascade of Stat3 and ERK1/2. These experiments have shown that Sirt1 has a protective effect on AKI induced by sepsis and produces its protective mechanism by regulating the activation of NF-kB.
To sum up, Sirt1 plays a protective role in acute lung and kidney injury induced by sepsis. Sirt1 exerts its protective function mainly by regulating the activation of nuclear transcription factors, which in turn leads to the activation of inflammatory pathways such as Stat3, ERK1/2 and caspase. Therapeutic targets for injury.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R459.7

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3 唐e

本文編號(hào)：2196904