發(fā)布時(shí)間：2018-07-01 17:35

  本文選題：膿毒癥 + 消退素�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：【研究目的】 膿毒癥（sepsis）是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS），其病理基礎(chǔ)是病原體誘發(fā)的炎癥反應(yīng)過(guò)度激活以及后期的炎癥反應(yīng)紊亂或免疫抑制，病理生理過(guò)程極其復(fù)雜，牽涉到多個(gè)臟器和系統(tǒng)、多類(lèi)細(xì)胞以及多種信號(hào)傳導(dǎo)通路。巨噬細(xì)胞在膿毒癥各階段中均具有非常重要的作用。 消退素D1（resolvin D1，RvD1）是由二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）中合成的一種強(qiáng)效的抗炎促吸收脂類(lèi)調(diào)節(jié)子，其可通過(guò)受體依賴機(jī)制調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬功能。本課題擬在小鼠盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型中觀察RvD1對(duì)膿毒癥小鼠免疫功能的影響，并在體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞中初步探索RvD1的作用機(jī)制。 【研究方法】 1、采用盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）致膿毒癥小鼠模型。32只C57BL/6小鼠接受CLP手術(shù)后隨機(jī)分成兩組，分別于手術(shù)后即刻接受尾靜脈注射RvD1（100ng/只）或者等量安慰劑處理，觀察小鼠8天生存率。 2、將16只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（SHAM，n=4），盲腸結(jié)扎穿孔模型組（CLP，n=6）和RvD1處理組（CLP+RvD1，n=6）。CLP模型后24h收集各組小鼠肺臟組織、外周血血漿、腹腔灌洗液、脾臟及胸腺。HE染色觀察各組小鼠肺組織病理變化；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)板法檢測(cè)小鼠血及腹腔細(xì)菌菌落形成單位（CFUs），比較各組小鼠血及腹腔細(xì)菌清除率；ELISA法檢測(cè)小鼠外周血細(xì)胞因子TNFα、IFN γ、IL 6、IL 10水平；流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)外周血和腹腔灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)目、外周血單核細(xì)胞（PBMC）數(shù)目以及脾臟巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠胸腺CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率。 3、將15只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（SHAM，n=3），盲腸結(jié)扎穿孔模型組（CLP，n=3），余下9只小鼠接受盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)后分別接受不同劑量RvD1（1ng、10ng、100ng）尾靜脈注射處理。CLP術(shù)后24h時(shí)Western blot法檢測(cè)各組肺組織磷酸化NF κB和總的NF κB水平。 4、將9只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（SHAM，n=3），盲腸結(jié)扎穿孔模型組（CLP，n=6）。CLP模型后6h（n=3）和24h（n=3）收集各組小鼠肺臟，提取肺組織RNA，RT-PCR法檢測(cè)各組NLRP3炎性體表達(dá)變化。將12只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（SHAM，n=3），盲腸結(jié)扎穿孔模型組（CLP，n=3），ResolvinD1低劑量組（10ng，n=3）和Resolvin D1高劑量組（100ng，n=3）。CLP模型后24h收集各組小鼠肺臟，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3及NF-κB表達(dá)變化。 5、將12只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（SHAM，n=3），盲腸結(jié)扎穿孔模型組（CLP，n=3），Resolvin D1低劑量組（10ng，n=3）和Resolvin D1高劑量組（100ng，n=3）。CLP模型后24h收集各組小鼠外周血，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞。Western blot法檢測(cè)各組NLRP3表達(dá)變化。 6、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后再用ATP（1mM）刺激，構(gòu)建NLRP3炎性體活化的體外模型。在LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞之前應(yīng)用RvD1（10ng/ml）預(yù)處理或者在LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞之后應(yīng)用RvD1（10ng/ml）后處理，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表達(dá)變化。 7、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后再用ATP（1mM）刺激，構(gòu)建NLRP3炎性體活化的體外模型。在LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞之后應(yīng)用不同劑量的RvD1（1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml）處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表達(dá)變化。 8、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后用RvD1（10ng/ml）處理，之后應(yīng)用ATP（1mM）或者不用ATP進(jìn)一步刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表達(dá)變化，RT PCR法檢測(cè)各組NLRP3表達(dá)變化。 9、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氯化鉀（KCl，75mM）或氯化鈉（NaCl，75mM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）處理，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表達(dá)變化，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL 1β水平。 10、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗氧化劑N 乙酰半胱氨酸（NAC，N acetylcysteine，10μM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）處理，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表達(dá)變化，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL 1β水平。 11、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入組織蛋白酶B抑制劑（CA 074 Me，10μM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）處理，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表達(dá)變化，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL 1β水平。 12、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入胞吞抑制劑細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D，5μM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）處理，Western blot法檢測(cè)各組NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表達(dá)變化，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL 1β水平。 13、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，應(yīng)用si RNA干擾NLRP3表達(dá)，然后用RvD1（10ng/ml）處理，觀察RvD1對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。 14、體外分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS預(yù)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）處理， CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)生存巨噬細(xì)胞數(shù)目，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡巨噬細(xì)胞比率。 【研究結(jié)果】 1、與對(duì)照組相比，尾靜脈注射RvD1可顯著提高盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP）致膿毒癥小鼠8天生存率（P0.05）。 2、 RvD1尾靜脈注射處理可減輕CLP模型后24hCLP小鼠肺臟組織病理?yè)p傷程度；顯著減少CLP模型后24hCLP小鼠血及腹腔細(xì)菌含量；CLP模型后24h，小鼠外周血細(xì)胞因子TNFα、IFN γ、IL 6、IL 10水平顯著升高，Resolvin D1處理可降低CLP小鼠外周血TNFα、IFN γ、IL 6、IL 10水平；RvD1尾靜脈注射處理CLP模型小鼠24h小鼠腹腔中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著減少，但小鼠外周血中性粒細(xì)胞數(shù)目、單核細(xì)胞數(shù)目以及小鼠脾臟巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯變化；RvD1尾靜脈注射處理可顯著減輕CLP模型后24hCLP小鼠胸腺CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率。 3、 CLP模型后24h小鼠肺組織磷酸化NF κB明顯活化，Resolvin D1尾靜脈注射處理可以劑量依賴性地抑制NF κB活化。 4、 CLP模型后6h各組小鼠肺臟NLRP3炎性體mRNA表達(dá)水平明顯升高，Resolvin D1尾靜脈注射處理可劑量依賴性地抑制NLRP3炎性體表達(dá)。 5、CLP模型后6h，Resolvin D1尾靜脈注射處理可劑量依賴性地增強(qiáng)小鼠外周血單核細(xì)胞NLRP3炎性體表達(dá)。 6、Resolvin D1（10ng/ml）預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞可抑制NLRP3炎性體各組件表達(dá)，而在LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞之后應(yīng)用Resolvin D1（10ng/ml）后處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)NLRP3炎性體各組件的表達(dá)。 7、在LPS刺激小鼠腹腔培養(yǎng)巨噬細(xì)胞之后應(yīng)用Resolvin D1后處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，能劑量依賴性地增強(qiáng)NLRP3炎性體各組件的表達(dá)。 8、在LPS刺激小鼠腹腔培養(yǎng)巨噬細(xì)胞之后應(yīng)用Resolvin D1后處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，可以在無(wú)NLRP3炎性體直接激動(dòng)劑ATP存在的情況下激活NLRP3炎性體。 9、在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，細(xì)胞外高濃度氯化鉀可抑制細(xì)胞內(nèi)的鉀離子外流，降低Resolvin D1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體激活作用。 10、在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，抗氧化劑N 乙酰半胱氨酸（NAC，N acetylcysteine，10μM）能降低Resolvin D1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體激活作用。 11、在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，組織蛋白酶B抑制劑（CA 074 Me，10μM）能降低Resolvin D1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體激活作用。 12、在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，胞吞抑制劑細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D，5μM）不能降低Resolvin D1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體激活作用。 13、 si RNA干擾NLRP3表達(dá)后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力下降， RvD1（10ng/ml）處理可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能。 14、應(yīng)用Resolvin D1處理體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，生存的巨噬細(xì)胞數(shù)目以及凋亡巨噬細(xì)胞比率無(wú)變化。 【結(jié)論】 Resolvin D1在盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型致膿毒癥（Sepsis）小鼠中可減輕小鼠全身炎癥反應(yīng)，并且增強(qiáng)小鼠對(duì)病原微生物的清除率，從而提高膿毒癥小鼠的生存率。Resolvin D1增強(qiáng)小鼠對(duì)病原微生物的清除作用可能與其能激活小鼠腹腔單核巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體有關(guān)，Resolvin D1對(duì)小鼠腹腔單核巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體的激活作用可能與細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流以及線粒體相關(guān)活性氧產(chǎn)生相關(guān)。
[Abstract]:Purpose of research

sepsis ( sepsis ) is a systemic inflammatory response syndrome caused by infection , the pathological basis of which is that pathogen - induced inflammatory response is over - activated and post - inflammatory response disorder or immunosuppression , and the pathological process is extremely complex , involving multiple organs and systems , multi - type cells and various signal transduction pathways .

In this study , the effect of RvD1 on the immune function of sepsis mice was investigated by receptor - dependent mechanism , and the mechanism of RvD1 was determined in mouse macrophages cultured in vitro .

Methodology of research

Methods Thirty - two C57BL / 6 mice were randomly divided into two groups after CLP operation . RvD1 ( 100 ng / L ) or equivalent placebo were given immediately after operation , and the 8 - day survival rate was observed .

2 . Sixteen C57BL / 6 mice were randomly divided into sham operation group ( SHAM , n = 4 ) , cecal ligation perforation model group ( CLP , n = 6 ) and RvD1 treatment group ( CLP + RvD1 , n = 6 ) . The lung tissues , peripheral blood plasma , peritoneal lavage fluid , spleen and thymus were collected 24 hours after CLP , and the pathological changes of lung tissues in each group were observed by HE staining .
The bacterial colony forming unit ( CFUs ) of mouse blood and abdominal cavity was detected by nutrition agar culture plate method , and the blood and abdominal bacterial clearance of each group were compared .
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本文編號(hào)：2088545